中藥多糖的分離純化方法研究進展*

張 巖,馬麗娜,陶遵威

(1.天津中醫(yī)藥大學,天津 300073； 2.天津市醫(yī)藥科學研究所,天津 300020)

多糖(polysaccharides,PS),是一類天然高分子化合物,是由醛糖或酮糖通過苷鏈連接在一起的聚合度超過10的多聚物,在生物體內(nèi)作為能量物質(zhì),存在于一切細胞膜結(jié)構(gòu)中,參與細胞的各種生理活動,是維持生命活動正常運轉(zhuǎn)的基本物質(zhì)之一。多糖也是中藥活性成分之一,具有許多藥理活性和藥效功能[1-3],在免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗凝血、降血糖、降血脂、抗輻射、抗菌、抗感染、抗病毒、保護肝臟和抗衰老等方面具有獨特的功效,而且多糖來源廣泛且無毒,具有較高的開發(fā)價值。因此,對中藥多糖的研究開發(fā),越來越引起國內(nèi)外科研工作者的興趣,并成為當前的研究熱點。在我國,中藥多糖研究近幾年發(fā)展得非常迅速,但多糖的分離純化以及分析方法基于效率和成本等多方面的考慮,尚無公認、有效、統(tǒng)一的模式,運用各種分離純化方法對不同植物多糖的開發(fā)、比較和分析,仍是研究工作的焦點之一。因此,本文就近年來有關(guān)中藥多糖的分離純化方法做一概述,以期為多糖的相關(guān)研究及進一步開發(fā)利用提供參考。

1 多糖的分離純化

從中草藥中提取的粗多糖,一般含有許多雜質(zhì),主要有無機鹽、單糖、寡糖、低分子量的非極性物質(zhì)及高分子量的有機雜質(zhì)，需進一步除去雜質(zhì)、分離并進行精制,方可進行下一步的研究。通常的步驟是先將極性差異較大的組分進行分離；再經(jīng)過除蛋白、脫色等處理；然后進一步將多糖按不同相對分子質(zhì)量進行分級。具體的方法根據(jù)中草藥的性質(zhì)不同而異。

1.1超濾膜分離法 超濾(UF)是一種膜分離技術(shù),所采用的超濾膜能夠從水和其他液體中分離出很小的膠體和大分子。將超濾膜用于多糖這種生物活性物質(zhì)的分離,具有不損害活性、分離效率高、能耗低、設(shè)備簡單、可連續(xù)生產(chǎn)、無污染等優(yōu)點,在多糖分離方面具有廣闊的應用前景[4,5]。李燕妮[6]探索了超濾法分離純化刺參酸性黏多糖的工藝。確定分離純化條件為:采用截留分子量8 kDa的超濾膜,壓力為0.3 MPa,溫度為10℃。此工藝制得多糖純度為93.4%,收率為0.32%,多糖截留率達到97.2%。王子堯等[7]采用切向流超濾技術(shù)分離丹皮多糖的截留率達到92.91%,多糖制品的純度達到84.2%,說明超濾是分離濃縮丹皮多糖的有效手段之一。Marnoch R 等[8]還應用超濾法純化了芥子蛋白。

1.2沉淀分離法 包括分步沉淀法和季銨鹽沉淀法。分步沉淀法根據(jù)多糖在不同濃度的低級醇或酮中具有不同溶解度的性質(zhì),逐次按比例由小到大加入這些醇或酮(常用的是甲醇、乙醇和丙酮)將不同相對分子質(zhì)量的多糖分別沉淀出來[9]。這種方法適宜于分離各種溶解度相差較大的多糖。閆巧娟等[10]用不同濃度乙醇沉淀黃芪水提液的方法獲得了黃芪多糖的不同相對分子質(zhì)量分布情況。此方法可結(jié)合動物實驗用于考查不同相對分子質(zhì)量多糖的生物活性。季銨鹽沉淀法根據(jù)長鏈季銨鹽能與酸性多糖成鹽,形成水不溶性多糖化合物的特性,常用于酸性多糖的分離。當溶液的pH值增高或加入硼砂緩沖液使糖的酸度增高,也會與中性多糖形成沉淀。常用的季銨鹽是十六烷基三甲基銨溴化物(CTAB)及其堿(CTA-OH)和十六烷基呲啶(CPC),其濃度一般為 1%～10%(W/V),其可在酸性、中性、微堿性或堿性中分級沉淀分離出酸性多糖[11]。陳海華等[12]采用CTAB絡(luò)合法分離得到酸性多糖(AFM)和中性多糖(NFM)粗制品。李宏燕等[13]經(jīng)正交試驗優(yōu)選出大棗多糖純化工藝體積比為1∶1加入2%(W/V)的 CTAB，35℃下保溫靜置4h。

1.3柱色譜法 根據(jù)柱填料的不同,柱色譜法既可用于多糖與其他極性差異較大組分的分離,也可用于多糖的脫色與分級。常用的柱層析方法有凝膠柱層析、陰離子交換柱層析和大孔樹脂柱層析。

1.3.1凝膠柱層析法 凝膠色譜利用分子篩原理,根據(jù)被分離物質(zhì)分子的大小和形狀不同而達到分離目的。常用的凝膠有葡聚糖凝膠(sephadex)和瓊脂糖凝膠(sepharose),以不同濃度的鹽溶液和緩沖溶液作為洗脫劑,使各種多糖得以分離純化,但不適宜黏多糖的分離。張體祥等[14]用Sephadex G-100凝膠柱層析對板藍根多糖進行分離,得到一種分子量均一的ISP 2多糖。洪閣等[15]用Sephadex G-200分離純化得到了銀耳堿多糖的均一組分TFBP-A 。高義霞等[16]將經(jīng)脫蛋白、脫色后的沙蒿多糖用 ultrahydrogel TM 500層析分離純化,0.1 mol/L磷酸緩沖液洗脫,在凝膠色譜中出現(xiàn)單一而對稱的峰,純化效果好、純度高。凝膠柱層析是目前植物多糖最常用的高級純化方法。

1.3.2陰離子交換柱層析法 陰離子交換柱層析適合于分離各種酸性、中性多糖和黏多糖。常用的交換介質(zhì)有DEAE-纖維素、DEAE-葡萄糖凝膠、DEAE-瓊脂糖凝膠,最常用的陰離子交換柱層析填料是DEAE-纖維素,既可純化多糖,還可分離各種多糖。洗脫劑可用不同濃度的堿溶液、硼砂溶液和鹽溶液等。在pH值為6時，酸性多糖能吸附于交換劑上,中性多糖不吸附。然后用pH值相同，但離子強度不同的緩沖液將酸性強弱不同的酸性多糖分別洗脫下來。但如果柱為堿性,則中性多糖也能吸附,吸附力一般隨多糖分子中酸性基團的增加而增加。羅婭君等[17]采用DEAE-纖維素柱層析從大葉金花草粗多糖中分離出中性多糖和酸性多糖。該方法主要用于多糖的初級純化。吳彥[18]將實驗得到的大薊粗多糖用DEAE-纖維素離子交換柱層析進一步分離純化,通過蒸餾水和NaCl溶液梯度洗脫,再通過透析、濃縮和冷凍干燥得到DJ1,DJ2,DJ3,DJ4和DJ5 5個次級組分。其中以0.4 mol/L NaCl溶液洗脫出的DJ2組分得率最高,為0.806%。

1.3.3大孔樹脂柱層析法 大孔樹脂分離技術(shù)應用于多糖,已有多個文獻對其進行了描述,主要用于提取液中多糖的純化以及脫色。如朱建飛等[19]用特1號大孔吸附樹脂對菜籽多糖水溶液脫進行脫蛋白和脫色,其效果良好。陳木森等[20]研究了8種樹脂對青錢柳多糖的靜態(tài)吸附性能,篩選出一種吸附較好的樹脂,并利用柱層析進行青錢柳多糖的純化研究。結(jié)果表明,D301R樹脂對青錢柳多糖吸附量最大,效果較好。但方積年等[9]認為,大孔樹脂吸附適合分離小分子物質(zhì),分離純化多糖易使多糖活性降低,故不宜使用。

1.3.4其他分離純化方法 除常用方法外,還有一些方法用于多糖的分離純化。如制備性區(qū)域電泳法,利用不同質(zhì)荷比多糖在電場作用下遷移速度不同而達到分離；鹽析法,根據(jù)不同多糖在不同鹽濃度中溶解度不同而達到分離；金屬絡(luò)合物法,利用多糖能與某些金屬離子(銅、鋇、鈣、鉛等)形成絡(luò)合物沉淀而分離；過氧化氫法與反膠束法也可以對多糖脫色使其得到純化。此外,結(jié)晶法、酶解法、透析袋法、超速離心法、親和色譜分級法、制備性高壓液相色譜、活性碳柱色譜法、離心沉淀色譜法、微波輔助及逆流色譜法(CCC)等方法[21-23]也有應用,但由于適應對象較少或技術(shù)要求較高而較少使用。

多糖的分離純化，如僅用一種方法難以獲得組分較單純的植物多糖,只有將兩種或多種純化方法有機地結(jié)合起來,充分利用每種純化方法的優(yōu)勢,才能使多糖組分高效的分離。

2 現(xiàn)狀與展望

多糖的藥理作用廣泛,以獨特的活性和低毒性的特點使其在臨床應用中具有很大的潛力。我國豐富的動植物資源為中藥多糖的開發(fā)提供了得天獨厚的條件,原料成本低廉、資源豐裕,為多糖提取的產(chǎn)業(yè)化應用提供了較大的發(fā)展空間。

然而,多糖的研究與蛋白質(zhì)和核酸的研究相比,還有相當?shù)牟罹?，這與多糖本身結(jié)構(gòu)比較復雜、種類繁多、其分離純化難度大、有些多糖含量低等諸多因素有關(guān),給多糖的研究和應用帶來許多的挑戰(zhàn),這還需要廣大科學工作者的繼續(xù)努力。多糖的分離純化方法在不斷更新,但在選取方法時,應當關(guān)注目標多糖的性質(zhì)和特點,綜合比較后進行實驗,才能選取最佳的方法和工藝。

因此,開展中藥多糖分離純化方法的研究,既可以為擴大該類藥物藥源提供了科學的依據(jù),又可以進一步促進多糖類藥物的發(fā)展,為開發(fā)出低毒、高活性的多糖類新藥提供理論依據(jù)。

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