無機(jī)解磷細(xì)菌的篩選、鑒定及其溶磷能力研究

陶 濤， 葉 明， 劉 冬， 楊 柳

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009)

自然界中大部分磷呈有機(jī)或無機(jī)磷化物狀態(tài)存在，而且施入的水溶性磷肥很快轉(zhuǎn)化為無效狀態(tài)，不能被作物直接利用[1]，在我國，耕作土壤缺磷面積約占總耕地面積的2/3[2]。磷細(xì)菌在土壤礦物質(zhì)形式的磷素轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用，與磷的轉(zhuǎn)化、貯存與供應(yīng)直接相關(guān)，能夠改善土壤環(huán)境，使土壤中有效磷含量提高[3，4]，因此，提高土壤中有效磷含量成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。據(jù)報(bào)道，具有解磷作用的微生物包括解磷細(xì)菌、解磷真菌和解磷放線菌，其中解磷細(xì)菌有芽孢桿菌屬(Bacillus)、歐文氏菌屬(Erw inia)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、土壤桿菌屬(Agrobacterium)、變形桿菌屬(Proteus)、沙雷氏菌屬(Serratia)、黃桿菌屬(Flavobacterium)、腸細(xì)菌屬(Enterbacter)、微球菌屬(M icrococcus)、固氮菌屬(Azotobacter)、根瘤菌屬(Brad yrhizobium)、沙門氏菌屬(Salmonella)、色桿菌屬(C lromobacterium)、產(chǎn)堿菌屬(A lcaligenes)、節(jié)細(xì)菌屬(Arthrobacter)、硫桿菌屬(Thiobacillus)、埃希氏菌屬(Escherichia)等[5-8]。本文研究了不同碳氮源、碳氮量、可溶性磷量及pH值對(duì)幾株解磷微生物溶解磷酸鈣能力的影響，為研發(fā)微生物肥料提供了科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

土樣采集于合肥市郊區(qū)水稻田。

培養(yǎng)基:牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基;無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基[9]。

1.2 優(yōu)良解磷菌株的篩選與鑒定

取10-5、10-4、10-3稀釋液0.1 m L涂布于PKO固體培養(yǎng)基平板上，每梯度涂 3個(gè)平板，30℃培養(yǎng)72 h。

隨機(jī)挑取平板上主要形態(tài)有明顯區(qū)別的代表性菌落，劃線到牛肉膏蛋白胨平板上，再挑取單菌落，劃線培養(yǎng)于牛肉膏蛋白胨斜面，在4℃保存，備用。

將具有解無機(jī)磷能力的菌株 Pp1、Pp2、Pp3、Pp4、Pp5、Pc1、Pc2、Pc3、Pc4、Pc5、Pc6、Pc8搖瓶培養(yǎng)，測其溶磷量。

根據(jù)菌株生理生化特征，參照文獻(xiàn)[10]對(duì)分離所得菌株進(jìn)行鑒定。

1.3 溶磷能力影響因素

(1)碳氮源種類。依據(jù)不同碳氮源的組合配制培養(yǎng)基，其中碳源分別為葡萄糖、蔗糖、玉米淀粉(均為10 g/L)，氮源(含氮量相同)分別為硫酸銨(0.5 g/L)、硝酸銨(0.30 g/L)、硝酸鉀(0.77 g/L)，無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基其它成分不變。

(2)碳源量。無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基的碳源加入量分別為2、6、10、14 g/L。

(3)氮源量。無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基的氮源為硝酸銨，加入量分別為0.1、0.3、0.5、0.7 g/L。

(4)可溶性磷量。在無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入K2 HPO4?3H 2O，加入可溶性磷量為0、1、5、10mg/L，以研究其對(duì)解磷的影響。

(5)pH值。調(diào)節(jié)無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基的pH值為4、5、6、7。

分析以上影響因素時(shí)的實(shí)驗(yàn)條件均為30℃下培養(yǎng)72 h(140 r/m in)。

1.4 搖瓶培養(yǎng)

向100 m L三角瓶中加入30 m L培養(yǎng)基，再接種1m L菌體懸浮液，菌數(shù)約為108cfu/m L，同時(shí)做空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)(加入1m L無菌水)，在30℃下培養(yǎng)72 h(140 r/m in)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

含磷量用鉬銻抗比色法測定，溶磷量以扣除對(duì)照值表示(m g/L)，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel和SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 優(yōu)良解磷菌株的篩選

各菌株的溶磷量如圖1所示，由圖1可知，各菌株溶磷能力差異較大，如菌株P(guān)c3的溶磷量高達(dá)174.08 m g/L，而菌株 Pc8的溶磷 量只有20.98mg/L，所以選取其中4株溶磷能力較強(qiáng)的菌株(Pc1、Pc3、Pp2、Pp3)研究。

圖1 各菌株的溶磷量

2.2 菌株鑒定

依據(jù)菌株的革蘭氏染色、芽孢染色、淀粉水解、明膠液化、檸檬酸鹽、硝酸鹽還原、三糖鐵、MR、VP、接觸酶、發(fā)酵型等生理生化實(shí)驗(yàn)結(jié)果及文獻(xiàn)[10]對(duì)菌株進(jìn)行鑒定的方法可知，Pc1、Pp2、Pp3屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株P(guān)c3屬于土壤單胞菌屬(Agromonas)。

2.3 碳氮源對(duì)微生物溶磷的影響

2.3.1 碳氮源種類

不同碳氮源組合對(duì)溶磷能力的影響如圖2所示。圖2中，1代表葡萄糖，2代表蔗糖，3代表玉米淀粉;a代表(NH 4)2 SO4，b代表NH4 NO3，c代表KNO3;培養(yǎng)條件為:溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速140 r/min、發(fā)酵時(shí)間72 h。圖3～圖6皆同。

由圖2可知，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3在不同碳氮源培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出不同的溶磷能力，差異較大，如菌株P(guān)c3在玉米淀粉、硝酸銨無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，其溶磷量為106.80 mg/L，表現(xiàn)出較強(qiáng)的溶磷能力;而在玉米淀粉、硝酸鉀無機(jī)磷基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，其溶磷量為-0.85 mg/L，這可能是因?yàn)榫關(guān)c3在此條件下溶磷活力受到限制，導(dǎo)致菌株P(guān)c3的增長繁殖除了要利用其自身溶解的有效磷，還需消耗磷酸鈣水解產(chǎn)生的有效磷，使得有效磷的質(zhì)量濃度低于對(duì)照值。

同時(shí)可以發(fā)現(xiàn)，在以不同碳氮源為培養(yǎng)基比較菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3溶磷能力，所得溶磷能力大小順序并不一致。

圖2 不同碳氮源組合對(duì)溶磷能力的影響

2.3.2 碳氮量

碳源量對(duì)菌株溶磷能力的影響如圖3所示。由圖3可知，Pc1的溶磷能力隨著碳源量的增加而增強(qiáng)(先快后慢)，Pp3在碳源量為2 g/L時(shí)，其溶磷量只有5.88mg/L，但當(dāng)碳源量達(dá)到6 g/L時(shí)，其溶磷量高達(dá)85.95m g/L，此后溶磷能力隨著碳源量增加又顯著降低，而Pc3、Pp2的溶磷能力則呈明顯波動(dòng)。

圖3 碳源量對(duì)菌株溶磷能力的影響

菌株溶磷能力與碳源量相關(guān)系數(shù)及其矩陣見表1所列。

由表1可知，菌株P(guān)c1的溶磷能力與碳源量的相關(guān)性關(guān)系顯著，菌株P(guān)c3、Pp2、Pp3的溶磷能力與碳源量的相關(guān)性關(guān)系不顯著。

表1 菌株溶磷能力與碳源量相關(guān)系數(shù)及其矩陣

氮源量對(duì)菌株溶磷能力的影響如圖4所示，由圖4可知，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3在氮源質(zhì)量濃度為0.1 g/L時(shí)，溶磷量均很小，菌株P(guān)p3溶磷量僅為7.23 mg/L，且菌株P(guān)c1的溶磷量在氮源質(zhì)量濃度為0.3 g/L，達(dá)到一個(gè)峰值后，又隨著氮源量的增加而增加，菌株P(guān)c3、Pp2、Pp3的溶磷量隨著氮源量的增加均顯著增加。

圖4 氮源量對(duì)菌株溶磷能力的影響

菌株溶磷能力與氮源量相關(guān)系數(shù)及其矩陣見表2所列。由表2可知，菌株P(guān)c3、Pp2、Pp3的溶磷能力與氮源量的相關(guān)性顯著，菌株P(guān)c1的溶磷能力與氮源量的相關(guān)性不顯著。

表2 菌株溶磷能力與氮源量相關(guān)系數(shù)及其矩陣

2.4 可溶性磷

可溶性磷對(duì)菌株溶磷能力的影響如圖5所示。由圖5可知，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3在不加入可溶性磷時(shí)，溶磷量均最高，菌株P(guān)c1、Pp2、Pp3在加入1 g/L可溶性磷時(shí)，溶磷量急劇下降，隨著可溶性磷量的增加而增加，菌株P(guān)c3的溶磷量隨著可溶性磷的變化，溶磷量波動(dòng)不大。

圖5 可溶性磷對(duì)菌株溶磷能力的影響

菌株溶磷能力與可溶性磷量相關(guān)系數(shù)及其矩陣見表3所列。由表3可知，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3的溶磷能力與可溶性磷量的相關(guān)性均不顯著。

表3 菌株溶磷能力與可溶性磷量相關(guān)系數(shù)及其矩陣

2.5 pH值

pH值對(duì)菌株溶磷能力的影響如圖6所示。由圖6可知，Pc1、Pc3、Pp3的溶磷量均隨著pH值的下降而升高，Pp2則在pH值為5時(shí)，溶磷量達(dá)到最大。

圖6 p H值對(duì)菌株溶磷能力的影響

菌株溶磷能力與pH值相關(guān)系數(shù)及其矩陣見表4所列。由表4可知，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp3的溶磷能力與pH值的相關(guān)性顯著，菌株P(guān)p2的溶磷能力與pH值相關(guān)性不顯著。

3 結(jié)束語

本實(shí)驗(yàn)中，從水稻根際共分離獲得13株具有解無機(jī)磷能力的菌株，選取其中4株溶磷能力較強(qiáng)的菌株作為研究對(duì)象，并依據(jù)文獻(xiàn)[10]對(duì)供試菌株進(jìn)行鑒定，結(jié)果表明，菌株P(guān)c1、Pp2、Pp3屬于芽孢桿菌屬(Bacillus)，菌株P(guān)c3屬于土壤單胞菌屬(Agromonas)，其溶磷量為 102.77～ 174.08 mg/L，是文獻(xiàn)[11]篩選的幾株解磷細(xì)菌溶磷量的3～4倍。

相關(guān)研究表明，不同菌株分解Ca3(PO4)2的能力有很大的差異[8]，此外，同一株磷細(xì)菌在利用不同的碳源時(shí)表現(xiàn)的溶磷能力并不一致[12，13]，這說明解磷細(xì)菌表現(xiàn)出的解磷能力與其所處環(huán)境有很大關(guān)系。

本研究發(fā)現(xiàn)同一菌株在不同碳氮源培養(yǎng)基上，表現(xiàn)出的溶磷能力差異較大，且菌株P(guān)c3、Pp2、Pp3的溶磷能力與碳氮源量相關(guān)性均顯著，而菌株P(guān)c1的溶磷能力與碳氮源量的相關(guān)性均不顯著。

磷是微生物生長繁殖的必需營養(yǎng)元素之一，不足或過多都將影響微生物的生長繁殖以及生理活性，但本研究表明，菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3菌株的溶磷能力與可溶性磷量的相關(guān)性均不顯著。大量的研究[3，14-16]發(fā)現(xiàn)，pH值與解磷量呈極顯著負(fù)相關(guān)，但也有報(bào)道[17，18]認(rèn)為兩者之間存在顯著的相關(guān)性。

本試驗(yàn)中Pc1、Pc3、Pp3的溶磷能力與pH值的相關(guān)性顯著，菌株P(guān)p2的溶磷能力與pH值相關(guān)性不顯著。菌株P(guān)c1、Pc3、Pp2、Pp3均具有高效解磷能力，關(guān)于其促生作用效果在進(jìn)一步研究中，從而為后期研發(fā)微生物肥料提供科學(xué)依據(jù)。

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4 結(jié)束語

本文由線彈性壓電層合結(jié)構(gòu)有限元?jiǎng)恿Ψ匠?，進(jìn)一步推導(dǎo)了壓電智能結(jié)構(gòu)的主動(dòng)控制方程。運(yùn)用ANSYS參數(shù)化語言(APDL)建立了四邊固支方形壓電智能板結(jié)構(gòu)的有限元模型，并進(jìn)行模態(tài)分析，將系統(tǒng)耦合有限元?jiǎng)恿Ψ匠剔D(zhuǎn)化到模態(tài)坐標(biāo)下的狀態(tài)空間方程。采用LQR全狀態(tài)最優(yōu)反饋控制，考慮離散分布式壓電致動(dòng)器/傳感器對(duì)于主結(jié)構(gòu)特征模態(tài)應(yīng)變/曲率分布的影響，分析了離散分布?jí)弘娭聞?dòng)器對(duì)系統(tǒng)各階模態(tài)的控制效果，結(jié)果表明:離散的分布式壓電致動(dòng)器/傳感器可有效控制板結(jié)構(gòu)的多模態(tài)振動(dòng);離散分布式壓電致動(dòng)器/傳感器對(duì)于主結(jié)構(gòu)特征模態(tài)應(yīng)變/曲率分布的影響較小，合理選擇壓電致動(dòng)器/傳感器的數(shù)量及分布與尋求最優(yōu)控制率一樣重要;壓電致動(dòng)器在對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生控制作用的同時(shí)，由于受其分布位置的影響可能會(huì)引起或加強(qiáng)系統(tǒng)其它模態(tài)的振動(dòng)。將本文數(shù)值算例結(jié)果與現(xiàn)有文獻(xiàn)結(jié)果進(jìn)行對(duì)比發(fā)現(xiàn)，配置9對(duì)壓電致動(dòng)器/傳感器可以使結(jié)構(gòu)各階模態(tài)的振動(dòng)得到理想的控制效果。

[參 考 文 獻(xiàn)]

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