Lachnum YM 328多糖發(fā)酵條件優(yōu)化及抗氧化性

陳吳西， 蔡敬民， 邱 濤， 張利兵， 葉 明

(1.合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，安徽合肥 230009;2.合肥學(xué)院生物與環(huán)境工程系，安徽合肥 230022)

0 引 言

真菌多糖是從真菌子實體、菌絲體、發(fā)酵液中分離出的，能夠控制細(xì)胞分裂分化、調(diào)節(jié)細(xì)胞生長衰老的一類活性多糖[1]。大量研究表明，多糖具有免疫增強與調(diào)節(jié)、抗病毒、抗放射、抗腫瘤、抗凝血、抗衰老以及抗氧化等作用[2-5]，是公認(rèn)的安全低毒活性物質(zhì)。

利用微生物生產(chǎn)多糖可以不受季節(jié)變化的影響，微生物多糖的收集與純化相對其它多糖而言更容易[6]，微生物多糖越來越受到人們的關(guān)注。粒毛盤菌屬Lachnum Retz是晶杯菌科(H ya-loscyphaceae)真菌，其分布廣泛，通常腐生在各種植物基質(zhì)上。近十幾年來，我國學(xué)者在粒毛盤菌方面做過不少研究[7-10]，人們發(fā)現(xiàn)粒毛盤菌屬中有的種能產(chǎn)生生物活性物質(zhì)，說明粒毛盤菌具有重要的應(yīng)用前景[11-13]。本文對一株粒毛盤菌YM 328發(fā)酵條件以及其胞外多糖抗氧化活性進行了研究，以期為盤菌多糖的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株及培養(yǎng)基

粒毛盤菌(Lachnum)YM 328，合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏菌種。

發(fā)酵培養(yǎng)基:液體PDA培養(yǎng)基。

1.2 YM 328胞外多糖的發(fā)酵、提取和測定

搖瓶培養(yǎng)條件為溫度25℃，轉(zhuǎn)速180 r/min，裝液量50 m L(容積為150 m L的三角瓶)，在此條件下培養(yǎng)10 d。

提取方法:將50m L發(fā)酵液過濾，濾液濃縮，加3倍體積的無水乙醇，4℃下醇沉。離心除去上清液，沉淀用蒸餾水溶解并定容至50 m L，加1m L 30%的H 2O2，50℃保溫脫色，Sevage法脫蛋白[14]，得到胞外多糖溶液。

采用苯酚-硫酸法測定多糖質(zhì)量濃度[15]，以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)物，用721E型可見光光度計作比色分析。

1.3 YM 328胞外多糖發(fā)酵條件

1.3.1 碳、氮源對菌株YM 328多糖發(fā)酵的影響

分別用20 g/LCMC-Na、蔗糖、淀粉、麥芽糖代替基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的葡萄糖配制不同碳源培養(yǎng)基各50 m L，裝入150 m L的錐形瓶中，用打孔器接入直徑為3mm的菌塊，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)10 d，測定多糖質(zhì)量濃度。分別以5 g/L蛋白胨、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素、酵母膏為氮源[16]，并選擇最適碳源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，方法同上。

1.3.2 金屬離子對YM 328多糖發(fā)酵的影響

選擇最適碳氮源配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別添加0.01 g/L硫酸錳、硫酸亞鐵、硫酸鋅、硫酸銅和硫酸鎂，以不加金屬離子的發(fā)酵液為對照。調(diào)節(jié)pH值為最適，接種菌齡相同菌塊裝于50m L不同生長因子發(fā)酵培養(yǎng)基的 150 m L錐形瓶中，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng) 10 d，測定多糖質(zhì)量濃度。

1.3.3 時間對YM 328多糖發(fā)酵的影響

選擇最適碳氮源和最佳生長因子配制發(fā)酵培養(yǎng)基，并調(diào)節(jié)最適pH值，接入直徑3 mm的菌塊，25℃、150 r/m in搖床培養(yǎng)6、8、10、12、14 d，測定多糖質(zhì)量濃度。

1.3.4 正交試驗

在單因素試驗基礎(chǔ)上，以碳源、氮源、金屬離子為3因素，各取4個水平，選擇L16(45)正交表進行試驗。

1.4 YM 328胞外多糖抗氧化活性測定

1.4.1 胞外多糖對?OH的清除作用

按照Sm irnoff的方法(有改動)，利用H2 O2與Fe2+混合產(chǎn)生?OH，在體系內(nèi)加入水楊酸捕捉?OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在510 nm下有最大吸收。反應(yīng)體系中含 8.8 mmo l/L H2O2、9mmol/L FeSO4、9mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度(10、20、30、40、50、60 mg/L)的多糖溶液各1 m L，最后加H2O2啟動反應(yīng)，37℃反應(yīng)0.5 h，以蒸餾水為參比，在510 nm下測量不同質(zhì)量濃度下的吸光度。考慮到多糖本身的吸光值、以9 mm ol/L FeSO4、9 mmol/L水楊酸/乙醇、不同質(zhì)量濃度的多糖溶液和蒸餾水各1m L做為多糖的本底吸收值[17]。

清除率計算公式為:

其中，A0為空白對照液的吸光度;A x為加入多糖溶液后的吸光度;A x0為不加顯色劑H2 O2多糖溶液本底的吸光度。

[18]的方法進行。取3m L不同質(zhì)量濃度(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g/L)多糖溶液，2m L PBS溶液(pH值為 6.0)和 0.1 m L 200μg/m L NaNO2溶液于試管中，用水添加至10 m L后，將混合液置于37℃恒溫1 h。然后與等容積的G riess試劑(1%對氨基苯磺酸、0.1% N-1-萘基乙二胺、2.5%H3PO4)混合，靜置10 m in后，蒸餾水做參比，于538 nm處測其吸光度，同時測定對照樣(不含亞硝酸鈉，含有多糖)和空白樣(不含多糖，蒸餾水代替多糖)吸光度。VC作為樣品對照。亞硝酸鈉的清除活性公式為:

其中，S a為亞硝酸鈉的清除率;ODs為空白樣品的OD值;ODp為試驗的OD值;ODc為對照的OD值。

2 結(jié)果和分析

2.1 碳、氮源對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

當(dāng)以5 g/L蛋白胨為氮源，20 g/L麥芽糖、蔗糖、可溶性淀粉、葡萄糖和CMC-Na為碳源時，YM 328胞外多糖產(chǎn)量如圖1a所示。從圖1a可看出，以葡萄糖為碳源時，YM 328胞外多糖產(chǎn)量最高，說明以葡萄糖為碳源便于菌株YM 328的利用和多糖的積累。氮源對菌株YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響較大。當(dāng)以葡萄糖為碳源，酵母膏為氮源時，YM 328胞外多糖的產(chǎn)量最高，達到1.841mg/m L，如圖1b所示。

圖1 碳氮源對YM 328胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.2 金屬離子對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

金屬離子對菌株YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖2所示。由圖2可知，除Cu2+外，添加Mg2+、Fe2+、Zn2+、M n2+對YM 328胞外多糖的產(chǎn)量都有很大的影響，由此可以推測金屬離子對于多糖的合成起重要作用，具體機理尚待研究。

圖2 金屬離子對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.3 培養(yǎng)時間對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響

培養(yǎng)時間對YM 328胞外多糖發(fā)酵的影響如圖3所示。由圖3可知，YM 328胞外多糖發(fā)酵到10 d時，其產(chǎn)量達到1.548 mg/m L，隨著發(fā)酵時間的延長，多糖產(chǎn)量較穩(wěn)定，直到14 d后多糖產(chǎn)量有所下降。

圖3 培養(yǎng)時間對胞外多糖產(chǎn)量的影響

2.4 正交試驗

YM 328胞外多糖發(fā)酵的正交試驗極差分析結(jié)果見表1所列。

表1 YM 328胞外多糖發(fā)酵正交試驗結(jié)果

由表1可知，影響YM 328胞外多糖產(chǎn)量的因素依次是C(金屬離子)＞B(氮源)＞A(碳源)。由試驗結(jié)果可直接得其最佳組合為A3B3C2，最佳發(fā)酵條件為:ρ(葡萄糖)=20 g/L，ρ(酵母膏)= 5 g/L，ρ(硫酸錳)=0.075 g/L。這與直觀分析所得試驗多糖產(chǎn)量最大有差異，故進行驗證試驗。在此條件下進行驗證試驗得出胞外多糖最大產(chǎn)量為1.895m g/m L。

2.3.1.2 術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評分 納入了4個研究，共179例(SuperPATH組89例，傳統(tǒng)入路組90例)，經(jīng)χ2檢驗，研究間有異質(zhì)性 ( I2>50%)，采用隨機效應(yīng)模型進行統(tǒng)一Meta 分析。結(jié)果顯示：SuperPATH組術(shù)后6周后Harris髖關(guān)節(jié)功能評分優(yōu)于傳統(tǒng)入路組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(WMD=7.62，95%CI=2.09～13.16，P=0.007)。見圖2。

方差分析見表2所列。由表2可以看出，A因素對該多糖的產(chǎn)率沒有顯著影響，B因素對該多糖的產(chǎn)率具有顯著影響，C因素對其產(chǎn)量具有高度顯著影響。

表2 方差分析

2.5 YM 328胞外多糖對?OH的清除作用

YM 328胞外多糖對?OH的清除如圖4所示，由圖4可知，YM 328多糖對?OH有清除作用，而且隨著質(zhì)量濃度的增加，對?OH的清除作用增強，且清除能力均高于等質(zhì)量濃度的VC。

圖4 YM 328胞外多糖對?OH的清除作用

2.6 YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用

YM 328胞外多糖對亞硝基的清除如圖5所示，由圖 5可知，隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用逐漸增強，但清除能力均弱于等質(zhì)量濃度的VC。當(dāng)質(zhì)量濃度為1 g/L時，兩者對亞硝基的清除能力差異較大，分別為51.07%和65.32%。

圖5 YM 328胞外多糖對亞硝基的清除作用

3 結(jié)束語

本研究表明，碳源、氮源、金屬離子及培養(yǎng)時間對 YM 328胞外多糖產(chǎn)量都有不同程度的影響。在最佳發(fā)酵條件下，多糖產(chǎn)量比在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)條件下培養(yǎng)10 d的產(chǎn)量提高了36.27%，說明發(fā)酵條件對YM 328多糖代謝具有重要的調(diào)控作用。

YM 328胞外多糖對?OH和亞硝基離子的清除作用隨著多糖質(zhì)量濃度的增加，呈增強的趨勢。?OH是生物體內(nèi)主要的活性自由基，由它引發(fā)的體內(nèi)脂質(zhì)過氧化是機體衰老、心血管病及腫瘤發(fā)生的重要原因[19]。文獻[20]報道大球蓋菇多糖(質(zhì)量濃度為583.1 mg/L)對?OH的清除率為50%，而在本研究中40 mg/L的YM 328胞外多糖對?OH的清除率就已達到50.98%，這說明粒毛盤菌胞外多糖對?OH的清除作用較強，是一種很有開發(fā)潛力的抗氧化、防衰老的活性物質(zhì)。

[參 考 文 獻]

[1] Brauer D，K immons T，PhilipsM.Comparision of tw omethods for the quantitation of B-glucans from shiitake mushroom s[J].H erbs Spices Medicinal Plants，2007，13(3): 15-26.

[2] 歐陽學(xué)農(nóng)，余宗陽，王文武，等.香菇多糖抗炎作用的實驗研究[J].軍醫(yī)進修學(xué)院學(xué)報，2006，27(1):56-57.

[3] 侯 元，霍德勝，魏艷君，等.草蓯蓉多糖的抗腫瘤作用及免疫調(diào)節(jié)作用[J].吉林大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2007，33(2): 1022-1025.

[4] 聶少平，謝明勇，曹樹穩(wěn).純化茶多糖的抗氧化活性及其對兩種結(jié)腸癌細(xì)胞增殖抑制作用[J].營養(yǎng)學(xué)報，2007，29(1): 46-50.

[5] Lin C L，Wang CC，Chang SC，et al.Antioxidative activity of polysaccharide fractions isolated from Ly cium ba rbarum Linnaeus[J].International Jou rnal of Biological Macromolecules，2009，45(2):146-151.

[6] Selbmann L，Onofri S，F(xiàn)enice M.Production and structural characterization of the exopolysaccharide of the Antarctic fungus Phoma herbarum CCFEE 5080[J].Research in M icrobiology，2002，153(9):585-592.

[7] ZhuangW Y，Wang Z.Some new speciesand new recordsof Discomycetes in China:Ⅷ[J].M ycotaxon，1998a，66: 429-438.

[8] Zhuang W Y，Wang Z.Discomy cetes of tropical ChinaⅠ: collections from H ainan island[J].M ycotaxon，1998b，57: 21-23.

[9] Zhuang W Y，Wang Z.Discomycetes of tropical ChinaⅡ: collections from Yunnan[J].M ycotaxon，1998c，69: 339-358.

[10] Zhuang W Y，H yde K D.New species of Lachnum and Perrotia from Hong Kong[J].M ycologia，2001，93(3): 606-611.

[11] Stadler M，Anke H，A rendhdz W R，et al.Lachnumon and Lachnumo l A，new metabolitesw ith nematicidal and antim icrobial activities from the ascomycete Lachnum pa pyraceum(Karst)KarstⅠ:producing organism，fermentation，isolation，and biological activities[J].The Jou rnal of Antibiotics，1993，46(6):961-967.

[12] Stadler M，Anke H，Show R，et al.New m etabolites with nematicidal and an tim icrobial activities from the ascomycete Lachnum papyraceum(Karst)Ⅵ:structure determ ination of non-halogenated metabolites structu rally related tomycorrhizin A[J].The Journal of Antibiotics，1995，48 (2):154-157.

[13] Stadler M，Anke H，Sterner O.Metabolites w ith nematicidal and Antim icrobial activities from the ascomy cete Lachnum pap yraceum(Karst)KarstⅤ:production is olation and biologicalactivitiesof brom ine-containingmycorrhizin and lachnumon derivatives and four additional new bioactivemetabolites[J].The Journalof Antibiotics， 1995，48(2):149-153.

[14] Qin C G，Huang K X，Xu H B.Isolation and characterization of the loach，M isgu rnus Anguillicaudatus[J].Carbohydrate Polym ers，2002，49(3):367-371.

[15] Vinarta S C，MolinaO E，F(xiàn)igueroa LC，et al.A further insigh t into the practical applications of exopolysaccharides from Sclerotium rol fsii[J].Food H ydrocolloid s，2006，20(5):619-629.

[16] 李宜明，沈業(yè)壽，季俊虬，等.桑黃菌質(zhì)多糖的固態(tài)發(fā)酵及其抗氧化作用[J].合肥工業(yè)大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，29(12):1580-1583.

[17] Sm irnoff N，CumbesQ J.Hyo rxy l radicalscavenging activity of compatible solutes[J].Phy tochem istry，1989，28(4):1057-1060.

[18] 焦中高，劉杰超，周紅平，等.硫酸化修飾對紅棗多糖自由基和亞硝基清除活性的影響[J].中國食品學(xué)報，2007，7(2):17-21.

[19] 王 峰，王曉煒，陶明煊，等.大球蓋菇多糖清除自由基活性和對D-半乳糖氧化損傷小鼠的抗氧化作用[J].食品科學(xué)，2009，30(5):233-238.

[20] 鐘顏麟，彭志英，趙謀明.乳酸菌胞外多糖的研究[J].中國乳品工業(yè)，1999，27(4):7-10.