同型半胱氨酸對人臍靜脈內(nèi)皮細胞IκB和NF-κB表達的影響*

徐 倩 周曉慧 曹 凱 牛成偉 張金環(huán) 胡欣欣

同型半胱氨酸（homocysteine，Hcy）是非蛋白構(gòu)成型含硫的非必需氨基酸，是蛋氨酸代謝過程中的一個重要中間產(chǎn)物。研究表明Hcy可以促進動脈粥樣硬化及血栓的形成[1]。本研究通過觀察在Hcy刺激下人臍靜脈內(nèi)皮細胞（human umbilical veins en?dothelial cells，HUVECs）的核因子（NF）-κB、NF-κB抑制蛋白-α（IκB-α）的表達情況，探討Hcy致動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）的機制，為臨床預(yù)防治療AS提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、Hcy、四甲基噻唑氮藍（MTT）均購自Sigma公司，DMEM培養(yǎng)基購自Gibco公司，堿性成纖維細胞生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）購自pepro Tech公司。Trizol購自invitrogen公司。鼠抗人NF-κB p65抗體、β-actin抗體購自Santa Cruz公司。兔抗人IκB-α一抗，二抗（山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記）購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0購自寶生物工程（大連）有限公司。 HERAcell 150型CO2孵育箱（Heraeus公司）、LEICA DMIL 090-135.001型倒置顯微鏡（Wetzlar GmbH公司）、凈化工作臺（上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）、Multiskan Mk3酶聯(lián)儀（芬蘭）、DYY-7型轉(zhuǎn)移電泳儀（北京市六一儀器廠）、PTC-100（MJ RESEARCH, INC）、紫外可見分光光度計（DU800）購自BECKMAN COUL?TER公司。

1.2 HUVECs培養(yǎng)及分組 取健康剖宮產(chǎn)新生胎兒臍帶，PBS液沖洗干凈，用1∶1的0.1%Ⅰ型膠原酶和0.25%的胰酶-0.02% EDTA（V∶V=1∶1）消化13 min，收集消化液，1 000 r/min離心10 min后，棄上清，用含20%胎牛血清、10 μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基重懸，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24 h后換液，待細胞達到80%融合時，用0.125%胰酶-0.01%EDTA（V∶V=1∶1）傳代培養(yǎng)，實驗用第2、3代細胞，分組如下：正常對照組細胞加含20%胎牛血清和10 μg/L bFGF的DMEM培養(yǎng)基；Hcy劑量組細胞在加入上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再分為4組，分別加入2.5 mmol/L Hcy（H1）、5 mmol/L Hcy（H2）、10 mmol/L Hcy（H3）及15 mmol/L Hcy（H4）。

1.3 MTT法檢測細胞活性 將第2代HUVECs細胞以1.0× 108/L密度種于96孔板中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)至細胞達到80%融合時，按上述實驗分組處理，培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g/L MTT 20 μL繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸棄上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL。振蕩溶解后，用酶標(biāo)儀測定在波長490 nm處各孔的光密度（OD）值。

1.4 RT-PCR檢測不同濃度Hcy對HUVECs中NF-κB p65 mRNA表達的影響 將第2代HUVECs細胞接種于24孔培養(yǎng)板中，每孔加入Trizol 300 μL，提取各組細胞總RNA。按Ta?KaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver 3.0試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。NF-κB p65引物上游為5-GCACTTACGGATTCTGGT GG-3，下游為5-CTCAAACGCTGGTGTTAGGC-3；擴增片段426 bp。β-actin引物上游5-AGCGGGAAATCGTGCGT GAC-3，下游為5-ACATCTGCTGGAAGGTGGAC-3，擴增片段為453 bp。PCR反應(yīng)體系為20 μL。NF-κB p65 PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min，94℃變性30 s，57℃退火30 s，72℃延伸1 min，擴增30個循環(huán)。最后10℃延伸10 min。β-actin的退火溫度為58℃。取5 μL PCR產(chǎn)物上樣于2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外透射儀觀察并攝取圖象。NF-κB p65 mRNA相對表達強度=NF-κB p65 mRNA掃描值/β-actin掃描值。

1.5 Western blot檢測不同濃度Hcy對HUVECs中IκB-α蛋白表達的影響 將第2代HUVECs細胞接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，提取細胞總蛋白，用二喹林甲酸（BCA）法測定總蛋白濃度。取30 μL蛋白樣品上樣，SDS-PAGE電泳，電轉(zhuǎn)移2 h至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）的膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后與1∶200稀釋的兔抗人IκB-α一抗4℃孵育過夜，與1∶5 000稀釋的二抗室溫孵育1 h，再與化學(xué)發(fā)光試劑（ECL）室溫作用3 min，后曝光、顯影和定影。膠片掃描后，采用Quantity One軟件對顯影條帶進行分析，計算IκB-α條帶與β-actin條帶的灰度比值，作為IκB-α蛋白的相對表達水平。

1.6 免疫組化檢測各組HUVECs中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的變化 第3代細胞接種于有蓋玻片的小培養(yǎng)皿中。方法:（1）丙酮固定10 min。（2）3%H2O2封閉10 min。（3）滴加A液，37℃孵育30 min。（4）加鼠抗人NF-κB p65一抗（1∶50）于4℃過夜。（5）滴加B液，37℃孵育30 min。（6）滴加C液，37℃孵育30 min。（7）顯色，復(fù)染。以上每步之間用PBS洗3次，每次5 min。（8）脫水，封片。（9）在Mivnt顯微圖像分析系統(tǒng)下進行半定量分析。顯棕黃色顆粒為陽性。對采集的圖片中棕黃色陽性顆粒進行密度掃描，測平均灰度值，觀察NF-κB p65核轉(zhuǎn)移變化.

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 運用SPSS 11.5進行統(tǒng)計學(xué)分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD-t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞生長及NF-κB p65 mRNA表達的影響 H1組較對照組對正常細胞生長的抑制作用不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），其他各組與對照組間OD值差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05或P＜0.01）；Hcy抑制HUVECs的生長隨著濃度的升高有增強趨勢。H1、H2、H3及H4組較對照組NF-κB p65 mRNA的表達均明顯增強，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著濃度升高，Hcy對HUVECs細胞NF-κB p65 mRNA表達的影響呈遞增的劑量依賴趨勢，見圖1、表1。

表1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞活力及NF-kBP65 mRNA表達的的影響 （±s）

表1 不同濃度Hcy對HUVECs細胞活力及NF-kBP65 mRNA表達的的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n OD值 統(tǒng)計學(xué)處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.546 7±0.049 3 0.525 0±0.032 1 0.498 3±0.033 1 0.373 3±0.045 9 0.295 0±0.032 1 46.015組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）0.348 0.043＜0.001＜0.001組別 n NF-κB p65/β-actin 統(tǒng)計學(xué)處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.463 3±0.030 8 0.539 4±0.009 3 0.683 8±0.034 8 0.779 9±0.021 2 0.912 6±0.016 4 165.264＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.013＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001 0.001＜0.001

2.2 Western blot及免疫組化結(jié)果 H1、H2、H3及H4組IκB-α蛋白的表達與對照組比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），且隨著濃度的升高，IκB-α/ β-actin呈遞減趨勢。對照組NF-κB p65在細胞中基本無表達，Hcy各處理組HUVECs細胞中可見NF-κB p65陽性產(chǎn)物棕黃色顆粒，H1、H2組陽性表達顆粒較少，主要分布在細胞質(zhì)中；H3、H4組陽性表達顆粒明顯增加，胞質(zhì)及胞核內(nèi)均有分布，胞核內(nèi)明顯增加；H4組陽性表達顆粒核內(nèi)分布尤為明顯，見表2、圖2。

3 討論

高Hcy是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的一種獨立危險因素，流行病學(xué)的研究報道顯示，大約有40%的冠心病和腦血管動脈粥樣硬化的患者存在高Hcy血癥[2]。目前研究認為內(nèi)皮損傷是導(dǎo)致AS的始動因素之一[3]，并提出AS是一系列復(fù)雜的慢性炎癥反應(yīng)的過程[4]，在這一過程中NF-κB發(fā)揮重要的調(diào)控作用。

NF-κB是一種廣泛存在于真核細胞內(nèi)的基因多顯性轉(zhuǎn)錄核因子，控制著細胞因子、黏附因子等基因的表達。NF-κB的2個亞基p50、p65屬于DNA結(jié)合蛋白Rel家族[5]。一般情況下，NF-κB與抑制蛋白IκB結(jié)合，使NF-κB滯留在胞質(zhì)中呈非活性狀態(tài)[6]。受到刺激后，IκB激酶被激活，使IκB蛋白降解，NF-κB從多聚體上釋放出來，進入細胞核，與DNA結(jié)合，調(diào)控細胞因子、黏附分子及生長因子的基因表達[7]，因而使這些基因控制的細胞因子、黏附分子等增多。大量的單核細胞趨化蛋白、細胞間黏附分子促進單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附并向內(nèi)皮下遷移及泡沫化，從而形成脂質(zhì)條紋、纖維斑塊、粥樣斑塊，進而導(dǎo)致AS的形成[8]。

表2 不同濃度Hcy對HUVECs細胞IκB-α蛋白表達及NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響 （±s）

表2 不同濃度Hcy對HUVECs細胞IκB-α蛋白表達及NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的影響 （±s）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別 n IκB-α/β-actin 統(tǒng)計學(xué)處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 1.109 5±0.0120 1 1.036 9±0.0298 9 0.918 1±0.0440 1 0.597 1±0.0224 4 0.329 7±0.0243 0 394.652＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）0.011＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001組別 n NF-κB p65統(tǒng)計學(xué)處理P對照組（1）H1（2）H2（3）H3（4）H4（5）F 55555 0.022 6±0.003 3 0.103 6±0.017 6 0.227 8±0.020 1 0.599 7±0.039 1 0.822 2±0.024 9 1 223.400＊組比（1）∶（2）（1）∶（3）（1）∶（4）（1）∶（5）（2）∶（3）（3）∶（4）（4）∶（5）＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001＜0.001

本實驗結(jié)果顯示，隨著Hcy濃度的升高，細胞活力逐漸下降，細胞形態(tài)變化越來越差，表明Hcy對內(nèi)皮細胞有明顯的損傷作用，濃度越高損傷越嚴(yán)重；Hcy可使NF-κB p65 mRNA表達顯著增強，表明Hcy可促進NF-κB p65的轉(zhuǎn)錄；且隨著Hcy濃度的升高，IκB的含量下降，并呈劑量依賴趨勢。隨著Hcy濃度的升高，NF-κB p65激活后進入細胞核，NF-κB p65在細胞核中的含量明顯增多，表明Hcy對NF-κB具有激活作用。

綜上所述，Hcy不僅促進NF-κB轉(zhuǎn)錄水平的表達，而且可促使IκB的降解，使NF-κB p65被釋放、激活，進而轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)，提示進入細胞核內(nèi)的NF-κB p65在轉(zhuǎn)錄水平將可能促進其下游的趨化蛋白因子、細胞間黏附分子等基因表達，使單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附，進一步損傷血管內(nèi)皮，促進動脈粥樣硬化的形成和發(fā)展。由于NF-κB在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，促進AS形成的病理過程中起重要作用，因此可以通過抑制過度活化的NF-κB，下調(diào)其調(diào)控促炎因子的表達，抑制多種黏附分子及細胞因子，從而有效地抑制炎癥反應(yīng)，延緩和逆轉(zhuǎn)AS的發(fā)生和發(fā)展，為其預(yù)防和治療提供新的策略。

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