下肢槍彈傷感染繼發(fā)DIC 中IL-10 及其抗體的作用

王 瑋，林國(guó)強(qiáng)，李楠楠，杜 艷

槍彈傷是戰(zhàn)場(chǎng)上最主要外傷，限于戰(zhàn)場(chǎng)條件，槍彈傷后繼發(fā)感染，特別在形成膿毒血癥后，在未及時(shí)救治情況下，極易形成彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)，因?yàn)樵诖诉^程中容易出現(xiàn)連鎖的級(jí)鏈反應(yīng)，包括促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生，炎癥細(xì)胞移行、外滲，炎性介質(zhì)大量產(chǎn)生，以及凝血、纖溶系統(tǒng)激活，微血管通透性增加，最后導(dǎo)致DIC、多臟器功能衰竭和死亡［1］。如何有效防治槍彈傷感染后繼發(fā)DIC 是一個(gè)重要的軍事醫(yī)學(xué)課題。其中白細(xì)胞介素10(interleukin-10，IL-10)屬于在此過程中出現(xiàn)的一種作用廣泛的抗炎細(xì)胞因子，在體內(nèi)炎癥反應(yīng)及凝血功能調(diào)控方面均發(fā)揮著重要的作用［2］。本研究擬深入探討IL-10 在外傷后感染繼發(fā)DIC 過程中的作用機(jī)制，為防治外傷后感染繼發(fā)DIC 提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 槍械參數(shù) 軍用54 式手槍，7.62 mm 手槍彈，經(jīng)專業(yè)機(jī)構(gòu)校準(zhǔn):子彈出膛初速度430 ～435 m/s，彈丸重量5.5 g，撞擊能量508.48 ～520.37 J。

實(shí)驗(yàn)材料:內(nèi)毒素(LPS L2880 美國(guó)Sigma 公司)，凝血功能［包括凝血酶原時(shí)間(PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、血小板(PLT)、凝血酶時(shí)間(TT)、纖維蛋白原(FIB)］檢測(cè)試劑(法國(guó)SATGO公司)，D-二聚體檢測(cè)試劑盒(福州貝肯醫(yī)療設(shè)備有限公司)，IL-10、IL-1、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)單克隆抗體購(gòu)自santa cruz 公司。全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀及其配套試劑(美國(guó)Beckman Coulter 公司)，全自動(dòng)血凝儀(法國(guó)SATGO 公司)。

1.2 動(dòng)物模型制備及分組 參考有關(guān)文獻(xiàn)［3-4］及1999 年第六屆全國(guó)血栓與止血會(huì)議修訂的DIC 標(biāo)準(zhǔn)與宋善俊等［5］制定的動(dòng)物模型標(biāo)準(zhǔn)，制備家兔槍彈傷后感染繼發(fā)DIC 模型。DIC 評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn):①PT 較對(duì)照組延長(zhǎng)或縮短3 s 以上。②APTT 較對(duì)照組延長(zhǎng)或縮短5 s 以上。③血小板較對(duì)照組下降。纖維蛋白原較對(duì)照組進(jìn)行性下降。④實(shí)驗(yàn)組D-二聚體陽性。⑤腎臟、肺臟等臟器病理組織切片顯示微血管中有纖維蛋白微血栓形成。同時(shí)有上列3 項(xiàng)以上異常，即判斷為DIC。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物采用健康家兔16 只，雌雄各半，體重(2.5±0.5)kg，由廈門大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［使用許可證號(hào):SYXK(軍)2002-047)］。實(shí)驗(yàn)前對(duì)動(dòng)物涉及部位備皮。槍傷前動(dòng)物常規(guī)禁食12 h，自由飲水。5%鹽酸氯胺酮注射液20 mg/kg+0.05%硫酸阿托品注射液0.04 mg/kg 對(duì)兔臀部肌內(nèi)注射麻醉后，將兔行走位懸吊，四肢自然下垂，用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)槍(7.62 mm鋼心槍彈)距離2 m 處致傷雙后肢備皮區(qū)，盡量不使股骨骨折以便飼養(yǎng)，予不清創(chuàng)包扎，如有股動(dòng)脈活動(dòng)性出血應(yīng)予以結(jié)扎止血和包扎。

將實(shí)驗(yàn)家兔編號(hào)后隨機(jī)分為四組，每組4 只:對(duì)照組、單純槍彈傷組、單純感染組、槍彈傷合并感染組。各觀察時(shí)相點(diǎn)為經(jīng)耳緣靜脈滴注LPS 前1 h，及靜脈滴注后2、6、12、24 h。在上述各時(shí)間點(diǎn)取血后行PLT、PT、APTT、TT、FIB 及D-二聚體檢測(cè)。24 h 后給予氯胺酮靜脈麻醉處死家兔，取右側(cè)肺臟、腎臟置于10%甲醛中固定，行病理學(xué)檢查。

1.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)法定量檢測(cè)IL-10

經(jīng)耳緣靜脈滴注LPS 前1 h，及靜脈滴注后2、6、12、24 h 各抽取兔靜脈血5 ml，置于無菌干試管，分離血清存于4℃冰箱，等待測(cè)定。根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行各項(xiàng)細(xì)胞因子測(cè)試。

1.4 免疫印跡(WB)檢測(cè)TNF-α、IL-1 靜脈滴注LPS 后1 h 給予皮下注射IL-10(25 μg/kg)，然后取血檢測(cè)TNF-α、IL-1［6］。

1.5 WB 檢測(cè)應(yīng)用IL-10 抗體后IL-10 表達(dá)水平靜脈滴注LPS 后12 h 再皮下注射IL-10 抗體(10 mg/kg)，然后取血檢測(cè)IL-10［6］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，組間比較采用重復(fù)測(cè)量數(shù)據(jù)方差分析，兩兩比較采用Dunnett t 檢驗(yàn)，P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 四組家兔PLT 和凝血指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 對(duì)照組家兔凝血功能、血小板、D-二聚體檢測(cè)值均符合標(biāo)準(zhǔn)參照值;單純槍彈傷組，2 h 內(nèi)APTT/PT 值及D-二聚體值較對(duì)照組變化不大，12 h 后較對(duì)照組稍延長(zhǎng)，D-二聚體值較對(duì)照組略增加;FIB 及PLT 值變化無明顯規(guī)律，均未達(dá)到DIC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;槍彈傷后感染組，2 h 內(nèi)APTT 值較對(duì)照組稍延長(zhǎng)，6 ～24 h 內(nèi)APTT 較對(duì)照組、單純外傷組明顯延長(zhǎng);PLT 值隨時(shí)間延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì);D-二聚體持續(xù)陽性，且隨時(shí)間延長(zhǎng)，呈逐漸增高趨勢(shì)，均呈時(shí)間依賴性，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.01);PT/FIB值變化規(guī)律不明顯，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)合APTT、PLT、D-二聚體等指標(biāo)，槍彈傷后感染2 h 即達(dá)到DIC 診斷標(biāo)準(zhǔn)，未發(fā)現(xiàn)明顯低凝血期，而2 h 前可視為DIC 發(fā)生前期。單純感染組綜合APTT、PLT、D-二聚體等指標(biāo)也達(dá)到DIC 標(biāo)準(zhǔn)，但DIC 程度較槍彈傷后感染組輕，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表1。

2.2 各組家兔IL-10 檢測(cè)結(jié)果比較 單純槍彈傷組IL-10 水平與對(duì)照組相比，12 h 較對(duì)照組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。槍彈傷感染組與對(duì)照組及單純槍彈傷組相比，2 h 內(nèi)IL-10 表達(dá)水平兩組無明顯差異;2～6 h 開始明顯升高，而12 ～24 h 之間達(dá)到平臺(tái)期，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。槍彈傷感染組與單純感染組相比則無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見表2。

2.3 IL-10 對(duì)TNF-α、IL-1 等促炎因子影響 靜脈滴注LPS 后1 h(DIC 前期)應(yīng)用IL-10 治療后可以導(dǎo)致TNF-α、IL-1 等促炎因子表達(dá)降低(圖1)。

2.4 用藥后IL-10 水平的變化 靜脈滴注LPS 后12 h(DIC 發(fā)生)應(yīng)用IL-10 抗體(10 mg/kg)均可以有效降低IL-10 水平(圖2)。

3 討 論

戰(zhàn)場(chǎng)條件下嚴(yán)重感染甚至膿毒血癥是槍彈傷的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，槍彈傷部位不同，其并發(fā)癥不同，例如臟器損傷、出血休克、肝腎損害、感染等。槍彈傷和感染本身均可以通過自身機(jī)制激活凝血途徑、消耗凝血因子，槍彈傷后合并感染更容易誘發(fā)DIC，其相互關(guān)聯(lián)因素就在于多種細(xì)胞因子的作用。單純應(yīng)用抗生素、血漿、肝素等傳統(tǒng)療法，DIC 常常繼續(xù)發(fā)展，死亡率仍很高。因此，如何預(yù)防及尋求新的治療方法防治槍彈傷后感染繼發(fā)DIC 具有重要的軍事醫(yī)學(xué)意義。為研究槍彈傷感染與DIC 關(guān)系，選擇下肢槍彈傷，盡量避免產(chǎn)生臟器損傷等其他因素。

表1 靜脈滴注LPS 前后APTT、PLT、D-二聚體變化)

表1 靜脈滴注LPS 前后APTT、PLT、D-二聚體變化)

注:與對(duì)照組比較，aP ＜0.01;與單純槍彈傷組比較，bP ＜0.01，cP ＜0.05;與單純感染組比較，dP ＜0.05，eP ＜0.01，fP ＞0.05

指標(biāo) n－1 h 2 h 6 h 12 h 24 h APTT(s)對(duì)照組 4 17.73±0.47 17.43±0.32 17.20±0.36 17.27±0.47 17.57±0.55單純槍彈傷組 4 17.80±0.66 17.40±0.62 21.23±0.90 21.97±1.10a 20.80±0.95單純感染組 4 17.67±0.59 20.80±1.10a 23.63±1.03a 24.73±1.31a 22.96±1.25a槍彈傷感染組 4 16.90±0.82 22.53±0.78abd 25.50±1.20abd 27.50±1.25abd 25.76±1.20abe PLT(×109/L)對(duì)照組 4 532.33±44.65 516.00±31.76 513.33±25.03 525.36±41.49 512.66±37.09單純槍彈傷組 4 498.66±30.53 488.00±33.51 468.50±22.55 424.33±24.33a 460.34±25.32單純感染組 4 488.33±31.72 469.33±21.50 403.38±30.92a 277.66±17.62a 203.33±21.59a槍彈傷感染組 4 519.00±35.36 495.00±34.04 378.00±25.71abf 208.67±23.46abd 113.00±28.00abe D-二聚體(μg/μl)對(duì)照組 4 0.38±0.04 0.41±0.02 0.37±0.12 0.39±0.10 0.36±0.07單純槍彈傷組 4 0.36±0.05 0.49±0.07 0.80±0.10a 0.95±0.18a 0.54±0.17單純感染組 4 0.39±0.09 0.59±0.10a 1.09±0.12a 1.02±0.17a 0.82±0.09a外傷感染組 4 0.46±0.03 0.75±0.13acf 1.39±0.20abf 1.44±0.13abe 1.08±0.12abd

表2 靜脈滴注LPS 前后IL-10 表達(dá)變化()

表2 靜脈滴注LPS 前后IL-10 表達(dá)變化()

注:與對(duì)照組比較，aP ﹤0.01;與單純槍彈傷組比較，bP ﹤0.01

組別 n －1 h 2 h IL-10 6(nhg /L)12 h 24 h對(duì)照組 4 7.60±0.75 8.00±1.25 7.53±0.85 7.50±1.05 8.13±0.71單純槍彈傷組 4 7.11±0.62 8.57±0.91 9.40±0.80 10.83±1.00a 9.03±0.90槍彈傷感染組 4 6.75±1.04 10.92±0.97 17.53±1.54ab 26.03±2.33ab 28.83±3.25ab

圖1 皮下注射IL-10 后TNF-α、IL-1 等炎性因子的表達(dá)

圖2 WB 檢測(cè)IL-10 的表達(dá)

在炎癥反應(yīng)與凝血系統(tǒng)異常之間細(xì)胞因子具有橋梁樣作用，但各種不同細(xì)胞因子所起作用并不相同，TNF-α、IL-1 屬于促炎因子，而IL-10 既具有抗炎因子作用，又在調(diào)節(jié)凝血功能上具有特殊意義，其在DIC 發(fā)展的不同階段具有雙刃劍作用［7］，需要進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，恰當(dāng)應(yīng)用IL-10 或者IL-10 抗體，可以限制槍彈傷后感染繼發(fā)DIC 的進(jìn)程。

在槍彈傷及隨后膿毒血癥形成期而尚未達(dá)到DIC 階段可以認(rèn)為處于DIC 前期，此期特別是形成膿毒血癥時(shí)TNF-α、IL-1 等促炎因子表達(dá)明顯增多。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)檢測(cè)IL-10 水平，發(fā)現(xiàn)其較對(duì)照組等無明顯變化，但相對(duì)于TNF-α、IL-1 等促炎因子存在相對(duì)不足，此時(shí)需要增加應(yīng)用IL-10 發(fā)揮其抗炎作用，從而有利于延緩或者減輕DIC 進(jìn)展。而IL-10 的合成晚于促炎性細(xì)胞因子［2］，IL-10 約在槍彈傷感染后2 h 開始明顯上升，并隨著時(shí)間增加，說明此時(shí)IL-10的分泌過多。但是在外傷后感染向DIC 發(fā)展過程中，大量IL-10 的產(chǎn)生又會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重免疫抑制，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)膿毒血癥中后期IL-10 水平明顯升高者其死亡率更高，就是因?yàn)槠溆袊?yán)重的免疫抑制作用［8-9］。感染不能控制，會(huì)加重DIC 進(jìn)程，故在感染及DIC發(fā)展過程中又必須發(fā)現(xiàn)機(jī)體代償性分泌過多IL-10的時(shí)效性，并恰當(dāng)應(yīng)用IL-10 抗體中和其不良反應(yīng)，防止DIC 的進(jìn)展。

IL-10 對(duì)凝血功能的影響主要通過劑量依賴性抑制TNF-α 作用，間接抑制血小板活化、黏附功能以及vWF(von willebrand 因子)功能，并抑制纖溶系統(tǒng)激活［10］。本研究證實(shí)IL-10 可以導(dǎo)致TNF-α、IL-1等促炎因子表達(dá)降低，提示其抗炎機(jī)制及對(duì)凝血功能調(diào)節(jié)均與拮抗IL-1、TNF-α 的功能有關(guān)。由于TNF-α主要在嚴(yán)重感染及DIC 前期大量產(chǎn)生，故預(yù)防性應(yīng)用IL-10 必須在DIC 前期才能產(chǎn)生好的效果。

本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)單純下肢槍彈傷后不容易形成DIC，可能與槍彈傷強(qiáng)度不夠有關(guān)，但加入感染因素后則很容易形成DIC，并且DIC 陽性的各項(xiàng)指標(biāo)也較單純感染組有實(shí)際意義，提示加強(qiáng)槍彈傷后感染防治是戰(zhàn)場(chǎng)條件下的重要任務(wù)。

綜上所述，本研究認(rèn)為槍彈傷后感染極易誘發(fā)DIC，選擇合適的時(shí)機(jī)應(yīng)用IL-10 或者IL-10 抗體有利于治療槍彈傷后感染繼發(fā)DIC。

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