ε-聚賴氨酸在南美白對蝦保鮮上的應用

侯偉峰，謝 晶，林永艷

（上海海洋大學食品學院，上海 201306）

南美白對蝦（Penaeus Vanmamei）屬易腐食品，在捕撈、運輸、加工及貯藏過程中極易受細菌侵襲而腐敗變質(zhì)。特別是其死亡后，在酶類的作用下進行無氧降解，隨著糖原和ATP的減少，蝦體開始變硬，并很快進入僵硬期，當體內(nèi)的ATP分解完后，蝦肉會進一步降解，直至腐敗變質(zhì)。另外，蝦體內(nèi)存在大量的多酚氧化酶，能夠使蝦體表面產(chǎn)生雙酚類物質(zhì)，再轉(zhuǎn)變成有色的醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)具有較高的活性，極易與氨基酸或蛋白質(zhì)結(jié)合成黑色素，從而導致蝦的黑變[1]。傳統(tǒng)的保鮮方法如低溫保藏、化學防腐劑保藏因其方法在防黑變和安全上的局限性已遠遠不能滿足人們對南美白對蝦貨架期的要求。

ε-聚賴氨酸（以下簡稱ε-PL）是目前天然防腐劑中具有優(yōu)良防腐性能的微生物類食品防腐劑。ε-PL最早是由日本的Shima和Sakait在白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）的發(fā)酵液中被分離得到的，它是由25～30個賴氨酸殘基聚合而成的[2]，有較強的抑菌能力，具有安全性高、抑菌譜廣、pH范圍大、熱穩(wěn)定性好等特點[3]，ε-PL在人體內(nèi)分解后能夠產(chǎn)生人體所必需的氨基酸——賴氨酸，因此安全性較高，已于2003年10月被FDA批準為安全食品保鮮劑。目前，ε-PL的在日本已實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但該保鮮劑的應用在國內(nèi)還處在實驗室階段，ε-PL生物防腐劑開發(fā)和生產(chǎn)還處于起步階段，而在南美白對蝦保鮮上的應用更是空白，因此具有較大的研究意義。為了延長南美白對蝦貨架期，優(yōu)化保鮮劑的選擇，筆者研究了不同濃度的ε-PL在南美白對蝦保鮮中的應用，以期為ε-PL在食品保鮮中的應用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要設備及試劑

試驗材料：鮮活南美白對蝦（購自上海市南匯新蘆苑農(nóng)貿(mào)市場），聚乙烯（PE）加厚保鮮袋（上海豪亞塑料制品有限公司）。

主要設備：Kjeltec2300凱氏定氮儀（瑞士FOSS公司）；Sartorins PB-10精密數(shù)顯酸度計（賽多麗斯科學儀器（北京）有限公司）；UV-3000 PC型紫外可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；YXQLS-30SH全自動立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設備廠）；DHP-9162型電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；潔凈工作臺（蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司），電熱鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）。

主要試劑：ε-PL（食品級，浙江銀象生物工程有限公司）；平板計數(shù)瓊脂（北京陸橋技術(shù)有限責任公司）；硼酸、輕質(zhì)氧化鎂、甲基紅、溴甲酚綠、無水乙醇、甲苯、碳酸鈉等，均購于國藥集團化學試劑有限公司，試劑均為AR級。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料處理 采集大小均一健康的南美白對蝦，?；钸\回實驗室，剔除死亡、肢體殘缺、變色等異常個體，用自來水沖洗，放入碎冰水中猝死。隨機分 5 組，編號分別為 CK、A1、A2、A3、A4，其中 CK 為對照組，其他為添加ε-PL組，ε-PL用無菌蒸餾水進行溶解配比。分組后的南美白對蝦在不同濃度ε-PL溶液中浸泡3min，取出室溫下1 min內(nèi)瀝干（必要時用超凈風吹干），立刻裝入無菌保鮮袋，標記于4±1℃冰箱內(nèi)儲藏9 d。對照CK組用無菌蒸餾水代替ε-PL溶液。

1.2.2 分組方法 ε-PL對細菌的最低抑菌濃度（MIC）中的最大量是150μg/mL[2]，在應用中常以2倍MIC進行添加，因此一般選擇的添加量為0.03%左右。通過蝦體吸水性試驗，結(jié)果表明，蝦體對保鮮劑溶液的吸收率為5.2%，因此，在實際研究中，ε-PL 濃度設置以下分組：CK，0；A1，0.05%；A2，0.10%；A3，0.25%；A4，0.50%。

1.3 品質(zhì)指標及測定方法

處理好的蝦經(jīng)分組后，在4±1℃冰箱內(nèi)儲藏9 d，前4 d隔天測定感官指標、pH值、揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）、細菌總數(shù)（TBC）以及三甲胺（TMA）等品質(zhì)指標，后5 d每天各測一次，并分析不同處理組的差異。

1.3.1 感官品質(zhì)評定 依據(jù)對蝦的衛(wèi)生標準[4]，對蝦的感官品質(zhì)指標要求蝦體完整，體表有光澤；頭胸甲與體節(jié)間連接緊密，眼球飽滿突出，肌肉紋理清晰，有彈性，殼不易剝離，具有對蝦固有氣味，無任何異味。由6名感官評定人員組成感官品質(zhì)評定小組，對南美白對蝦從肌肉組織、體表色澤和氣味3方面進行綜合評分，取其平均值，總分值在9分（極新鮮）和0分（完全腐?。┲g，6分以下表明樣品已不可食用。隔天評定一次，并對各組評定結(jié)果進行統(tǒng)計分析。

1.3.2 pH值測定 取5 g經(jīng)組織搗碎機搗碎的蝦體肌肉于錐形瓶中，加入45mL無菌中性蒸餾水，靜置30min，過濾，用精密酸度計測定濾液的pH值[7]。

表1 南美白對蝦感官評分標準[5-6]

1.3.3 揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的測定 使用自動凱氏定氮儀，依據(jù)半微量凱氏定氮原理進行測定[8]。具體方法為準確稱取5 g搗碎樣品至FOSS消化管中，加入0.5 g的輕質(zhì)氧化鎂，上機測定。重復3次，取平均值。

1.3.4 菌落總數(shù)的測定 按照GB/T 4789.2-2008規(guī)定的傾注平板計數(shù)法進行[9]，每個梯度做三個平行。

1.3.5 三甲胺（TMA）的測定 利用分光光度計法測定南美白對蝦中的三甲胺含量[10-11]。稱取試樣5 g（可根據(jù)三甲胺含量適當增減，精確至0.000 1 g）置于100 mL容量瓶中，加入蒸餾水至刻度，振蕩15 min，過濾至100 mL容量瓶中。取此液5.00 mL置于25mL有蓋試管中，另取5mL水做空白試驗，分別加入1 mL碳酸鎂甲醛溶液、10.00 mL甲苯、3 mL飽和碳酸鉀溶液，用力振搖1 min后靜置5 min。將甲苯層移入內(nèi)有0.5 g無水硫酸鈉的20mL有蓋試管中，脫水（甲苯層盡量多取，8～9 mL）。取此液5.00mL，在15mL試管中分別加5.00mL苦味酸甲苯溶液，混勻，在波長410 nm處比色，以試劑空白為參比液，測其吸光值。根據(jù)標準曲線，樣品三甲胺含量按如下公式計算：y=60.373 A，其中y為三甲胺含量，單位為μg/g，A為吸光值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel繪圖，利用SPSS17.0軟件進行試驗數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±平均偏差表示，利用t-檢驗進行組間分析，當p<0.01時為極顯著差異，0.010.05時差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 南美白對蝦感官品質(zhì)評定結(jié)果

南美白對蝦感官評定結(jié)果如表2所示。由表可知，隨著儲藏時間的延長，各處理組感官評分均呈下降趨勢，其中對照組CK下降速度最快，在第4天便達到5.53分，即低于6分，盡管樣品在氣味、組織方面仍為良好，但外觀已達到不可接受的界限，樣品已不可食用，這與凌萍華[12]的研究結(jié)果一致；而添加保鮮劑組（A1、A2、A3、A4）總分均明顯高于對照組（p<0.05），并且到第6天其感官總分才低于6分；在各處理組之間，除了在第4天A1和A2、A4之間及第5天A2和A3具有顯著差異外（p<0.05），其余均無顯著差異。這表明，少量的ε-PL對南美白對蝦有較好的保鮮效果，并且濃度之間的差異性不大。

表2 南美白對蝦感官品質(zhì)評定結(jié)果

2.2 南美白對蝦pH值的變化

南美白對蝦在儲藏的過程中，隨著時間的延長，其pH值會有一系列變化，Goncalves[13]通過在空氣包裝、冰蓄冷保藏、氣調(diào)包裝條件下處理北極甜蝦，認為在3種條件下，pH值不可接受值分別為7.56、7.64和7.55。Shamshad[14]認為墨吉對蝦的pH不可接受值為7.60。而動物性組織在儲藏的過程中，在死亡初期，由于血液循環(huán)和體內(nèi)供應氧的停止，會發(fā)生糖酵解作用生成琥珀酸、乳酸等有機酸，從而導致肌體pH值下降，隨著時間的延長，細菌滋生，蛋白質(zhì)發(fā)生分解產(chǎn)生堿性物質(zhì)，pH值會逐漸上升[15]。

由圖1可知，南美白對蝦新鮮樣pH值為6.87，在第2天出現(xiàn)pH最低點，隨后的儲藏過程中，各組pH均呈上升趨勢，這與王四維[16-18]等對南美白對蝦的研究相似。由圖可知，對照組pH值明顯高于添加保鮮劑組（p<0.05），由此可見，ε-PL保鮮劑對蝦體pH上升有明顯的抑制作用。

圖1 不同聚賴氨酸濃度下蝦的pH值的變化

2.3 南美白對蝦揮發(fā)性鹽基氮（TVB-N）的變化

南美白對蝦經(jīng)不同濃度的ε-PL溶液處理后，其TVB-N的變化情況如圖2所示。TVB-N是指動物性食品在腐敗過程中，由于霉和細菌的作用，組織中的蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生的氨以及低級胺類等堿性含氮物質(zhì)。通?？捎肨VB-N作為水產(chǎn)品的腐敗評價指標，一般TVB-N隨著鮮度的下降而增加，對于蝦類，按照DB33/451—2003海捕蝦質(zhì)量要求規(guī)定[19]：海蝦一級、二級、三級鮮度的TVB-N值上限分 別 為 15 mg/100g、20 mg/100g、30 mg/100g。 當TVB-N值超過規(guī)定的三級鮮度時，一般認為不可食用。

圖2 不同聚賴氨酸濃度下蝦的揮發(fā)性鹽基氮的變化

由圖2可知，各組TVB-N值隨著儲藏時間的延長呈上升趨勢，對照組CK在整個過程中上升速度較快，并且在第2天TVB-N值已經(jīng)超過一級鮮度上限，為18.755 2 mg/100g，而用ε-PL處理后的南美白對蝦，在第4天才達到一級鮮度上限，而此時對照組已接近二級鮮度上限。對照組和試驗組從第4天開始，TVB-N的差異極顯著（p<0.01），但經(jīng)ε-PL溶液處理的各組，TVB-N的差異不顯著（p>0.05）。在整個試驗過程中，經(jīng)ε-PL處理的組別均未達到規(guī)定的三級鮮度上限，但根據(jù)感官評定結(jié)果，從第6天開始，蝦的感官已經(jīng)不可接受，因此被認為不可食用。

2.4 南美白對蝦菌落總數(shù)（TBC）的變化

南美白對蝦菌落總數(shù)的變化情況如圖3所示。由圖可知，對照組的菌落總數(shù)呈直線上升，并且上升速度較快，其他試驗組也呈上升趨勢，在儲藏的第2天，各組差異不明顯（p>0.05），但此后試驗組菌落總數(shù)均顯著低于對照組（p<0.01）。根據(jù)Mosfer M[20]研究，蝦類的菌落數(shù)≤5.0 lg（cfu/g）為一級鮮度；5.0～5.7 lg（cfu/g）為二級鮮度，當細菌總數(shù)超過二級鮮度時，通常認為蝦已腐敗不可食用，此時判定為貨架期的終點。

由圖3可知，對照CK組在第4天菌落總數(shù)已達到5.6 lg（cfu/g），即將超過二級鮮度，與對照組相比，其他各試驗組菌落總數(shù)最高的為A4組，僅為4.4 lg（cfu/g），仍在一級鮮度以下；從第5天開始，對照組菌落總數(shù)已超過二級鮮度，而其他試驗組在第7天才超過一級鮮度指標。這與南美白對蝦TVB-N的變化情況一致。可見，ε-PL可抑制南美白對蝦菌落的生長，具有良好的防腐保鮮作用。

圖3 不同聚賴氨酸濃度下蝦的菌落總數(shù)的變化

2.5 南美白對蝦三甲胺（TMA）的變化

三甲胺[（CH3）3N]是由氧化三甲胺[（CH3）3NO]在細菌的作用下還原生成的，氧化三甲胺廣泛分布在豬肉、魚肉和蝦中，它具有特殊的鮮味。同時，生物體內(nèi)的卵磷脂經(jīng)微生物作用也分解產(chǎn)生三甲胺[21]。生成的三甲胺越多說明豬肉和魚蝦的鮮度越差。圖4為不同濃度的ε-PL處理下，南美白對蝦的三甲胺隨時間的變化情況。由圖可知，樣品三甲胺的初始值為0.510 1μg/g。在儲藏的前4天，各組三甲胺含量均呈明顯的上升趨勢，這可能是由于在蝦體腐敗變質(zhì)的初期，三甲胺含量增加。三甲胺為最簡單的叔胺，其沸點僅為24℃，在常溫下為無色氣體，易于揮發(fā)，在其后的6天里，三甲胺的含量有一定的波動，可能主要是較高的室溫造成一定的揮發(fā)所引起的，具體的原因還有待進一步的研究。但總體而言，除了A3組外，對照組明顯高于其他各試驗組（p<0.05），特別是A1組在第5、7和9天，A2組在第8天，三甲胺含量低于其他組，由此可知，ε-PL對南美白對蝦的保鮮作用并不是濃度越大效果越好，在最適的濃度條件下才能取得最好的保鮮效果。

圖4 不同聚賴氨酸濃度下蝦的三甲胺的變化

3 結(jié) 論

不同濃度的ε-PL溶液對南美白對蝦保鮮效果的研究結(jié)果表明：與對照組相比，ε-PL能明顯延長南美白對蝦貨架期2～3 d；通過感官評定、TVB-N、pH、菌落總數(shù)和三甲胺指標的測定，ε-PL處理后的試驗組均與對照組有顯著的差異（p<0.05），但試驗組間差別并不明顯。各濃度的比較分析認為用0.1%的ε-PL溶液處理南美白對蝦，能夠取得較好的效果。但黑變分析表明，盡管ε-PL能夠明顯降低蝦的菌落總數(shù)和TVB-N，但在防黑變的效果方面并不理想，因此單一保鮮劑的利用具有一定的弊端，在今后的研究中期望通過不同保鮮劑的復合利用，以進一步完善南美白對蝦的保鮮效果，延長其貨架期。

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