不同類(lèi)型栽培半夏同工酶分析

韓 鳳，韋 波，封孝蘭，全 健，曹厚強(qiáng)，梁正杰

（重慶市藥物種植研究所，重慶 408435）

半夏[Pinellia ternata（Thunb.）Breit]是我國(guó)重要的傳統(tǒng)中藥材，也是重要的出口產(chǎn)品。具燥濕化痰、降逆止嘔、消痞散結(jié)之功效，主治痰多咳嗽、嘔吐反胃、胸脘痞氣等癥。廣泛分布于我國(guó)長(zhǎng)江流域以及東北、華北等地區(qū)[1]。生長(zhǎng)于不同環(huán)境或同一生態(tài)環(huán)境的不同居群，甚至同一居群的不同個(gè)體間，半夏的各種器官(包括根、球莖、珠芽、葉片、葉柄等)在形態(tài)上都存在著豐富的變異類(lèi)型，其中以葉、球莖和珠芽的變異更明顯[2-5]，具體表現(xiàn)為種內(nèi)居群間出現(xiàn)不同程度的分化現(xiàn)象，這必將影響到藥材質(zhì)量的穩(wěn)定。生產(chǎn)上推廣種植的半夏均是一個(gè)復(fù)雜的混合群體，因此選育高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)和多抗的半夏新品系已成為育種工作者的當(dāng)務(wù)之急。為此，本研究以同一生長(zhǎng)期的栽培半夏葉片為材料，通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)對(duì)其過(guò)氧化物同工酶（POD）、酯酶同工酶（EST）的檢測(cè)和分析，從分子水平探討栽培半夏的種內(nèi)分化情況，為半夏的資源收集和優(yōu)良品系的選育提供更多的遺傳背景資料。

1 材料和方法

1.1 供試材料及設(shè)備

于5月上旬重慶市藥物種植研究所標(biāo)本園采摘栽培的半夏。根據(jù)葉片的形狀分為竹葉葉型（Ⅰ）、橢圓葉型（Ⅱ）、芍藥葉型（Ⅲ）、心葉型（Ⅳ）。電泳設(shè)備為DYCZ-28A型電泳槽及DYY-12型電腦三恒多用電泳儀。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 聚丙烯酰胺凝膠的制備 按胡能書(shū)等[6]的方法制備聚丙烯酰胺凝膠，每板12個(gè)點(diǎn)樣槽。分離膠濃度7.5%，濃縮膠濃度3%。

1.2.2 酶液的制備 將半夏的葉片用蒸餾水沖洗干凈，用吸水紙吸干水分后，各稱取2 g加Tris-HCl（pH值8.2）提取緩沖液5mL，冰浴中充分研磨成勻漿，低溫下3 500 r/min離心20 min，上清液為酶的粗提取液，加少量40%蔗糖混合均勻，置冰箱中冷藏備用。

1.2.3 電 泳 用50μL微量進(jìn)樣器吸取酶液點(diǎn)在樣品槽中，加入2滴溴酚藍(lán)指示電泳前沿。在4℃冰箱中恒壓電泳，起始電壓為112 V，待示蹤指示劑進(jìn)入分離膠后增大到210 V，待溴酚藍(lán)移至距膠前沿1 cm處停止電泳，電泳全過(guò)程為4 h。

1.2.4 染 色 過(guò)氧化物酶同工酶用醋酸-聯(lián)苯胺法染色；酯酶用乙酸-α-萘酯、乙酸-β-萘酯及固藍(lán)B鹽染色，待酶帶清晰用蒸餾水漂洗后，置7.5%冰醋酸中固定。選取酶帶清晰重復(fù)性好的膠版攝影，根據(jù)酶譜中酶帶的遷移率大小和酶帶的強(qiáng)弱繪制酶譜模式圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 過(guò)氧化物酶（POD）同工酶

4個(gè)不同葉型半夏過(guò)氧化物酶（POD）同工酶電泳模式圖見(jiàn)圖1。由圖可見(jiàn)，供試的半夏過(guò)氧化物酶同工酶酶譜差異顯著，其具體表現(xiàn)為遷移率、酶帶數(shù)和酶帶強(qiáng)弱顯著不同，呈現(xiàn)出豐富的多態(tài)性。圖上共顯示出13條酶帶，酶帶的Rf值在0.032～0.836之間，其中有1條譜帶為所有供試材料共有，即Rf值為0.688的譜帶。由于遷移率的差異，整個(gè)酶譜從負(fù)極到正極可劃分為2個(gè)區(qū)域，即慢帶區(qū)（A區(qū)）和快區(qū)（B區(qū)），A區(qū)＜0.2，B區(qū)＞0.5。A區(qū)有6條酶帶，其中有2條為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ3種類(lèi)型所共有，Ⅰ類(lèi)型比Ⅱ、Ⅲ類(lèi)型多Rf=0.106這一條。Ⅳ類(lèi)型有3條酶帶Rf分別為0.032、0.053、0.089，都不同于其他3種類(lèi)型。

圖1 4個(gè)類(lèi)型半夏過(guò)氧化物酶（POD）同工酶電泳模式圖

2.2 酯酶（EST）同工酶

4個(gè)不同葉型半夏酯酶（EST）同工酶電泳模式圖見(jiàn)圖2。供試材料共顯示出9條譜帶，Rf值在0.032 6～0.717 4之間，其中有3條譜帶是共有譜帶，即 Rf分別為 0.032 6、0.076 0、0.673 9，說(shuō)明它們都有較為相似的遺傳背景。Ⅲ、Ⅳ類(lèi)型譜帶最少，只有4條；Ⅱ類(lèi)型有5條譜帶；Ⅰ類(lèi)型最多，有7條。而Ⅱ、Ⅲ類(lèi)型分離酶帶有4條完全一致，除Ⅱ類(lèi)型比Ⅲ類(lèi)型多1條外，酶帶顏色深淺和遷移率均一致，說(shuō)明這兩種類(lèi)型具有共同起源的基因表現(xiàn)，而不同的譜帶說(shuō)明各自在特定的生長(zhǎng)環(huán)境或不同進(jìn)化過(guò)程中已經(jīng)發(fā)生了趨異分化，可將二者歸為一類(lèi)型加以選育。試驗(yàn)結(jié)果表明，所取4種不同葉型半夏的樣品，經(jīng)多次重復(fù)測(cè)試分析，其總趨勢(shì)是一致的，可劃分為3組，即Ⅰ為一類(lèi)型，Ⅱ、Ⅲ為同一類(lèi)型，Ⅳ為一類(lèi)型。

圖2 4個(gè)類(lèi)型酯酶（EST）同工酶電泳模式圖

3 結(jié)論與討論

（1）細(xì)胞學(xué)研究結(jié)果已證明半夏是一個(gè)復(fù)合多倍體，個(gè)體間的差異從本試驗(yàn)的2種同工酶酶譜分析結(jié)果也得到了證實(shí)。共有的特征性譜帶可認(rèn)為是相互之間具有共同起源的基因表現(xiàn)，而不同的譜帶說(shuō)明各自在特定的生長(zhǎng)環(huán)境或不同的進(jìn)化過(guò)程中已發(fā)生了趨異分化。

（2）過(guò)氧化物、酯酶同工酶電泳數(shù)據(jù)分析表明半夏不同類(lèi)型之間既有共同酶帶，又有各自的特征酶帶，酶譜反映了半夏不同類(lèi)型之間的相互聯(lián)系與區(qū)別。試驗(yàn)證明在同一栽培條件下，不同個(gè)體葉片的過(guò)氧化物酶、酯酶同工酶，除少數(shù)特征譜帶外，多數(shù)譜帶的出現(xiàn)頻率有較大差異，指標(biāo)在半夏不同類(lèi)型之間具有特異性，且與半夏在形態(tài)學(xué)上的差異性是一致的，可用作分類(lèi)鑒定依據(jù)之一。

（3）半夏不同類(lèi)型之間譜帶的差異表現(xiàn)在特征酶帶顏色深淺不同，寬度不同，遷移率也不同，這一方面說(shuō)明了這些材料間存在著共同的遺傳基礎(chǔ)，或者說(shuō)，它們之間有不同程度的親緣關(guān)系；另一方面也反映了各材料間存在著不同程度的遺傳差異。

[1] 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所.中藥志（第2冊(cè)第2版）[M].北京：人民衛(wèi)生出版社.1993.

[2] 陳 宏.半夏研究進(jìn)展[J].現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2010，（5）：80-81.

[3] 裴建文，孫新榮，王 鵬，等.施肥對(duì)半夏總蛋白質(zhì)含量的影響[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（2）：79-83.

[4] 程霞英，陶曉曄.三葉半夏組織培養(yǎng)研究 [J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，（3）：1643-1645.

[5] 郭巧生，沈文飚，劉 麗，等.半夏種內(nèi)不同居群酯酶和超氧化物歧化酶同工酶酶譜特征分析 [J].植物資源與環(huán)境學(xué)報(bào)，2001，10（2）：42-46.

[6] 胡能書(shū)，萬(wàn)賢國(guó).同工酶技術(shù)及其應(yīng)用[M].長(zhǎng)沙：湖南科技出版社，1985.74-75.