轉小粒野生稻基因組DNA水稻的光合性狀研究

匡 勇，袁 嬌，夏石頭，黃志遠，孫一丹，趙炳然

（1.湖南農業(yè)大學科學技術處，湖南 長沙 410128；2.湖南農業(yè)大學生物安全學院，

湖南 長沙410128；3.湖南農業(yè)大學生物科學技術學院，湖南 長沙 410128；4.國交雜交水稻工程技術研究中心，湖南雜交水稻研究中心，湖南 長沙 410125）

水稻是我國最重要的糧食作物之一，兩系雜交水稻的推廣和應用對我國乃至世界的糧食生產(chǎn)將產(chǎn)生極為深遠的影響[1]。發(fā)掘和開發(fā)新的遺傳種質以提高兩系雜交水稻的雜種優(yōu)勢是雜交水稻研究的重要課題。野生稻如小粒野生稻（Oryzaminuta，BBCC染色體組型）含有高產(chǎn)、病蟲抗性等基因，不僅耐逆能力強，而且持久抗稻瘟病、稻飛虱等病蟲害，發(fā)掘、轉移這些基因是水稻育種中的一個重要方向，轉移遠緣物種基因組DNA是一條不同于常規(guī)理化誘變的種質創(chuàng)新途徑。對基因組DNA進行直接操作，可能是利用遠緣有利基因、培育超級雜交稻行之有效的技術途徑。目前，外源DNA導入水稻的途徑主要有“花粉管通道法”[2]及種苗“浸泡法”，前者結實率低，籽粒易產(chǎn)生霉變、發(fā)芽率較低，操作時間又受到花時的限制，后者DNA用量較多且轉化率較低。在Pena等[3]程序基礎上，國交雜交水稻工程技術研究中心趙炳然等[4]用自行改良的“穗頸注射法”創(chuàng)造出一系列新種質材料。在此基礎上，作者以其中新種質野威B及其受體親本V20B為材料，研究了小粒野生稻基因組DNA轉移對受體水稻的光合性狀的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗采用轉小粒野生稻基因組DNA水稻野威B及其受體親本V20B為材料，由國交雜交水稻工程技術研究中心提供。

1.2 試驗設計

試驗在國家雜交水稻工程技術研究中心實驗田中進行。采取隨機區(qū)組設計，重復3次，小區(qū)面積20.0 m2，密度20 cm×20 cm，插單本。小區(qū)呈長方形，重復和區(qū)間設走道，實驗區(qū)周圍設保護區(qū)。田間管理同大田生產(chǎn)管理。

1.3 項目測定及方法

于始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）、臘熟期（Ⅴ期）分別到田間各小區(qū)隨機取樣，用美國CID公司的CI203型葉面積儀測定葉片葉面積與長寬比，參照《植物生理學實驗技術》[5]用80%丙酮浸提法提取葉綠素，用分光光度法測定葉綠素含量。光合速率、氣孔導度、蒸騰速率等指標的測定采用美國LICOR公司的LI6400光合測試系統(tǒng)，采用開放式氣路，光通量密度為850 μmol/（m2·s），溫度為30℃。分別于9月1日（Ⅰ期）和9月18日（Ⅱ期）測定倒1（劍葉）、倒2、倒3葉光合性狀，測定時間為上午 9∶00～10∶00。

2 結果與分析

2.1 小粒野生稻（Oryzaminuta）DNA的導入和野威B材料的獲取

以V20B水稻親本作為野生稻（Oryzaminuta）DNA的受體材料，于田間選受體劍葉與倒2葉葉枕距1～5 cm的主穗，剝開部分倒2葉葉鞘以露出穗頸節(jié)下第1節(jié)間，然后將醫(yī)用微量進樣器針尖傾斜（約30°）從穗頸節(jié)部位朝下插入穗頸節(jié)下第1節(jié)間注射DNA。每穗注入50μLOryzaminuta基因組DNA溶液（DNA為1×SSC溶液，濃度為300～600 μg/mL）。種子收獲后單粒繁殖，從260株D1植株中篩選出1株變異株，變異株繁殖后從D2代中選出優(yōu)良單株，D3代開始與V20A測交，D4代開始成對回交，經(jīng)多代回交和系選，選育成變異系野威B。

2.2 轉Oryzaminuta基因組DNA水稻野威B的株葉形態(tài)和葉綠素含量

轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B和親本V20B在株葉形態(tài)上有十分明顯的差異，野威B的株型較V20B松散，莖較V20B細小，倒3葉葉片較窄、較直立。在始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）、乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期）分別到田間各小區(qū)隨機取樣，并用葉面積儀測定葉片的長、寬和葉面積（表1）后，發(fā)現(xiàn)在始穗期（Ⅰ期），轉O－ryzaminuta基因組DNA的野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積均顯著小于親本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉長、葉寬也小于親本V20B，且倒1和倒2的葉長、倒2葉葉寬與受體親本之間的差異達到了顯著水平。在齊穗期（Ⅱ期），野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積雖小于親本V20B的，但只有倒1葉的葉面積與受體親本之間的差異達到了顯著水平。而在乳熟期（Ⅲ期）、黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），野威B的倒1、倒2和倒3葉葉面積均顯著小于親本V20B，野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉長、葉寬也小于親本V20B，有的差異達到顯著水平。進一步的研究發(fā)現(xiàn)（圖1、圖2），隨著水稻成熟野威B的倒1葉和倒2葉，從始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），其葉綠素含量逐漸降低，但其與受體親本V20B之間的差異未達到顯著水平。

表1 轉Oryzaminuta基因組DNA野威B水稻的葉面積、葉長和葉寬

圖1 不同時期倒1葉葉綠素含量變化

圖2 不同時期倒2葉葉綠素含量變化

2.3 轉Oryzaminuta基因組DNA水稻野威B的光合性能和蒸騰速率

圖3 不同時期倒3葉葉綠素含量變化

轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B和親本V20B的光合性能和蒸騰速率如表2。由表2可知，在2個測定時期，轉Oryzaminuta基因組DNA的野威B的倒1、倒2和倒3葉片的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率。除第Ⅱ個時期倒1葉的氣孔導度與親本V20B的氣孔導度沒有顯著差異外，其他時期野威B的倒1、倒2和倒3葉的氣孔導度均顯著高于親本V20B的。在第一個測定時期，野威B的倒1、倒2和倒3葉片的蒸騰速率均顯著高于親本V20B各對應時期的蒸騰速率，但在第Ⅱ個時期，兩者之間的規(guī)律不明顯。

表2 轉Oryzaminuta基因組DNA野威B水稻的光合速率、氣孔導度和蒸騰速率

3 討論

轉移遠緣物種基因組DNA是一條不同于常規(guī)理化誘變的種質創(chuàng)新途徑，對基因組DNA的直接操作，可能是一種利用遠緣有利基因、培育超級雜交稻的行之有效的技術路線。外源DNA導入水稻的途徑，多是運用“花粉管通道法”[2]及種苗“浸泡法”。在Pena[3]程序基礎上，趙炳然、周建林等[4-9]用自行改良的“穗頸注射法”，創(chuàng)造出包括野威B在內的一系列新材料。而將3H-PBI121 DNA注入穗頸節(jié)下第一節(jié)間，放射性標記迅速在穗頸導管中出現(xiàn)，說明外源DNA通過導管運輸[10]。

本文研究發(fā)現(xiàn)，通過轉小粒野生稻（Oryza minuta）DNA而選育的變異系野威B，與親本V20B在株葉形態(tài)上有十分明顯的差異，野威B的株型較V20B松散，莖較V20B細小，倒3葉葉片較窄、較直立，而且野威B的倒1、倒2和倒3葉的葉面積均顯著小于親本V20B。從始穗期（Ⅰ期）、齊穗期（Ⅱ期）到乳熟期（Ⅲ期）再到黃熟期（Ⅳ期）和臘熟期（Ⅴ期），野威B和V20B的葉綠素含量逐漸降低，但兩者之間差異未達到顯著水平。野威B的倒1、倒2和倒3葉片的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率。研究表明[11]，作物生物學產(chǎn)量中，90%～95%的物質來自光合作用的產(chǎn)物，只有5%～10%的物質是來自根部吸收的營養(yǎng)物質。從光合作用與物質生產(chǎn)的角度看，水稻產(chǎn)量主要決定于光合面積、光合時間、光合速率和物質分配。在一定產(chǎn)量水平下，其中某一因素起主導作用[12]。野威B的光合速率均極顯著高于親本V20B的光合速率，可為雜交水稻超高產(chǎn)育種，為進一步提高雜交水稻品質提供了新的種質資源。

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