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    天花粉蛋白、米非司酮和順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞HLA-G表達(dá)的影響

    2011-03-07 05:55:38王建英馬俊英吳淑娟程建新李勇
    河北醫(yī)藥 2011年9期
    關(guān)鍵詞:天花粉司酮細(xì)胞株

    王建英 馬俊英 吳淑娟 程建新 李勇

    人類非經(jīng)典白細(xì)胞抗原HLA-G在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞表面大量表達(dá),是妊娠成功的必要條件,其在母胎免疫耐受方面的作用已經(jīng)得到公認(rèn),目前也是腫瘤免疫逃逸基礎(chǔ)研究的熱點(diǎn)之一。已有研究報(bào)道了黃體酮、絨毛膜促性腺激素、孕激素等可通過上調(diào)HLA-G的水平以達(dá)到保胎的目的,由此推測(cè)臨床的引產(chǎn)藥物如天花粉蛋白、米非司酮等引起流產(chǎn)的機(jī)制可能與其能下調(diào)HLA-G的水平有關(guān)[1],進(jìn)而推測(cè)這些藥物在免疫逃逸方面具有抗腫瘤作用。本部分研究首先篩查出表達(dá)HLA-G陽性的卵巢癌細(xì)胞株,進(jìn)而研究天花粉蛋白、米非司酮對(duì)其中HLA-G mRNA表達(dá)的影響,并與順鉑相比較,以其為卵巢癌的免疫治療提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    1.1.1 培養(yǎng)細(xì)胞:卵巢癌細(xì)胞株卵巢漿液性囊腺癌(SKOV3)、卵巢粘液性囊腺癌(3AO)、卵巢腺癌細(xì)胞株(OVCAR3),由河北省腫瘤研究所科研中心提供。高表達(dá)HLA-G的絨毛膜癌JEG-3細(xì)胞株,購于中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所計(jì)劃生育及生殖生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

    1.1.2 主要試劑:RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基購于美國(guó)Gibco公司;胎牛血清購于杭州四季青公司;四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購于Sigma公司;逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)試劑盒購于Fermentas公司;引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。HLA-G上游引物為 5,-AGA CGC CAA GGA TGG TGG TCA-3,下游引物為 5,-GCTCCA CGT CCTGGG TCTGGT-3;βactin上游引物5,-AAG AGA GGC ATC CTC ACC CT-3,下游引物為5,-GGA AGG AAG GCTGGA AGA TG-3。擴(kuò)增產(chǎn)物:HLAG為770 bp,β-actin為619 bp;HLA-G單克隆抗體購于英國(guó)Abcam公司;天花粉蛋白注射液購于上海金山制藥廠;米非司酮純品(RU486)購于北京紫竹藥業(yè)有限公司;順鉑購于山東齊魯制藥廠。

    1.1.3 儀器設(shè)備:酶標(biāo)儀 Fluostar(BMG,德國(guó));CO2培養(yǎng)箱(Heraeus,德國(guó));倒置顯微鏡(Olympus,日本);HEALORCE 超凈工作臺(tái)。PCR 儀(Mastercycler,eppendorf,德國(guó))、凝膠分析成像系統(tǒng)(VILBER,LourMAT,法國(guó))

    1.2 方法

    1.2.1 SKOV3、3AO、OVCAR3細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清、100 U/m l青霉素、100 g/m l鏈霉素,在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶消化,2~3 d傳代1次。

    1.2.2 JEG-3細(xì)胞培養(yǎng):用含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 g/ml鏈霉素、2 mmol/L的DMEM/F12培養(yǎng)液,在37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),以0.25%胰蛋白酶消化,2~3 d傳代1次。

    1.2.3 RT-PCR技術(shù):用Trizol試劑盒提取細(xì)胞總RNA,用紫外分光光度法定量RNA。將等量的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA第1鏈,以獲得的逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板,擴(kuò)增HLA-G和β-actin基因,使用凝膠分析系統(tǒng)對(duì)擴(kuò)增條帶進(jìn)行密度分析,以平均灰度值代表相應(yīng)基因的表達(dá)量,并除以β-actin的平均灰度值,所得數(shù)值做為各擴(kuò)增產(chǎn)物mRNA的相對(duì)表達(dá)量。擴(kuò)增條件:HLA-G為94℃預(yù)變性 3 min,94℃ 變性 45 s,55℃退火 45 s,72℃ 延伸1 min,30個(gè)循環(huán),72℃延伸7 min。1%瓊脂糖凝膠電泳80 V 30 min,觀察基因表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)6次。

    1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)比色法(MTT)測(cè)定:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2×105/ml,接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔100μl,貼壁培養(yǎng)24 h后分別加入不同濃度的藥物或?qū)φ找?00μl,每個(gè)濃度設(shè)6個(gè)復(fù)孔,每板設(shè)3個(gè)空白對(duì)照孔。細(xì)胞培養(yǎng)72 h后,每孔加入10μl MTT(濃度為5 mg/ml),繼續(xù)培養(yǎng)4 h后,棄培養(yǎng)液,每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μl,振蕩10 min,酶標(biāo)儀在600 nm處測(cè)定每孔吸光度(A)值,每個(gè)濃度6個(gè)平行孔,取平均值。并按如下公式計(jì)算各組細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次。細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率=(對(duì)照孔A值-實(shí)驗(yàn)孔A值)/對(duì)照孔A值×100%。80 V 30 min,觀察基因表達(dá)變化。實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

    1.2.5 藥物濃度:用不含胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液來調(diào)節(jié)天花粉蛋白和順鉑藥物濃度,每種藥物為5個(gè)濃度。天花粉蛋白注射液的終濃度 10、50、100、500、1 000 μg/ml。順鉑的終濃度為 1.5625、3.125、6.25、12.5、25 μg/ml。以等量的RPMI1640培養(yǎng)液為對(duì)照。

    米非司酮純品以無水乙醇溶解,配成10 mg/ml,再以RPMR1640培養(yǎng)液稀釋至所需濃度,試驗(yàn)組米非司酮終濃度分別為 2.5、5、10、20、40 μg/m l。為避免乙醇對(duì)試驗(yàn)的影響,設(shè) 5個(gè)乙醇對(duì)照組,使乙醇終濃度與各試驗(yàn)組乙醇含量一致。

    RT-PCR技術(shù):參照上述結(jié)果,選擇干預(yù)細(xì)胞的藥物濃度。天花粉蛋白注射液濃度為500、1 000μg/ml;米非司酮濃度為20、40 μg/m l;順鉑濃度為6.25、12.5 μg/ml。各組藥物分別作用于實(shí)驗(yàn)篩查出表達(dá)HLA-G陽性的OVCAR3細(xì)胞72 h。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料以±s表示,組間均數(shù)先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn),再進(jìn)行方差分析,用LSD法進(jìn)行兩兩比較,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 卵巢癌細(xì)胞HLA-GmRNA表達(dá) 以絨癌JEG-3細(xì)胞為陽性對(duì)照,人卵巢癌OVCAR3細(xì)胞株呈現(xiàn)HLA-G mRNA陽性表達(dá),可見擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為770 bp(HLA-G)和619 bp(β-actin)的特異性條帶。SKOV3和3AO細(xì)胞中均未檢測(cè)到HLA-G mRNA表達(dá)。見圖1。

    圖1不同細(xì)胞株HLA-GmRNA的表達(dá)

    2.2 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3生長(zhǎng)的抑制作用 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對(duì)OVCAR3細(xì)胞生長(zhǎng)抑制作用均呈濃度依賴性。見表1。

    表1不同藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3生長(zhǎng)的抑制作用±s

    表1不同藥物對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3生長(zhǎng)的抑制作用±s

    天花粉蛋白濃度(μg/ml)抑制率米非司酮濃度(μg/ml)抑制率順鉑濃度(μg/ml)抑制率0 0 0 0 0 0 10 1.06±0.14 2.5 8.00±1.21 1.5625 17.82±7.29 50 9.03±1.81 5 24.88±11.30 3.125 29.25±2.72 100 14.95±8.43 10 47.60±2.70 6.25 60.15±5.69 500 39.66±9.67 20 61.58±3.29 12.5 70.57±3.74 1 000 58.65±9.63 40 76.94±4.68 25 85.67±8.24

    2.3 天花粉蛋白、米非司酮、順鉑對(duì)OVCAR3細(xì)胞中HLA-G表達(dá)的影響 天花粉蛋白、米非司酮能明顯下調(diào)OVCAR3細(xì)胞中HLA-G mRNA表達(dá)水平(P<0.01),而順鉑卻無該方面作用(P >0.05)。見表2。

    表2 不同藥物對(duì)OVCAR3細(xì)胞中HLA-G表達(dá)的影響

    3 討論

    本課題組前期試驗(yàn)已經(jīng)表明HLA-G、HLA-E在卵巢癌免疫逃逸中起著重要作用,可做為臨床判斷腫瘤惡性程度、監(jiān)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)及判斷預(yù)后的一項(xiàng)腫瘤標(biāo)志物,提示若能找到某種藥物來下調(diào)或封閉HLA-G、HLA-E的表達(dá),就有可能為臨床卵巢癌免疫治療提供一個(gè)新的靶點(diǎn)[2]。

    本試驗(yàn)以絨癌JEG-3細(xì)胞做為陽性對(duì)照,檢測(cè)了不同卵巢癌細(xì)胞株中HLA-G的表達(dá)情況,結(jié)果表明在SKOV3細(xì)胞和3AO細(xì)胞都不表達(dá)HLA-G,只有在 OVCAR3細(xì)胞有 HLA-G mRNA電泳條帶出現(xiàn)。細(xì)胞系中HLA-G的表達(dá)低于腫瘤組織,同國(guó)外學(xué)者研究結(jié)果相似。Bukur等[3]研究發(fā)現(xiàn)在被檢測(cè)的30例腎癌腫瘤標(biāo)本中24例有HLA-G mRNA表達(dá),而在23個(gè)細(xì)胞系中僅12例有HLA-G mRNA表達(dá)。還有文獻(xiàn)報(bào)道HLA-G抗原在黑色素瘤標(biāo)本中近30%表達(dá),而在細(xì)胞系中卻不到1%[4]。分析產(chǎn)生這些差異的原因可能是:(1)不同腫瘤微環(huán)境的影響;(2)腫瘤浸潤(rùn)細(xì)胞的影響,因?yàn)樗鼈円脖磉_(dá)HLA-G;(3)在細(xì)胞培養(yǎng)過程中HLA-G抗原會(huì)逐漸部分丟失;(4)在建立穩(wěn)定傳代的細(xì)胞系過程中不可避免發(fā)生某種程度的細(xì)胞選擇,從而使HLA-G陽性細(xì)胞可能被篩選掉。

    本部分結(jié)果表明雖然不同卵巢癌細(xì)胞株表達(dá)HLA-G水平有所不同,但還是從細(xì)胞水平驗(yàn)證了HLA-G在卵巢癌免疫逃逸方面的作用。故以O(shè)VCAR3做為下一步進(jìn)行藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞株。

    王英?。?]研究發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白(TCS)可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞株SGC-7901凋亡,凋亡率與藥物濃度及作用時(shí)間呈正相關(guān)。王媛媛等[6]探討了TCS對(duì)人白血病和淋巴瘤細(xì)胞系的殺傷作用機(jī)制,結(jié)果表明TCS可以顯著抑制各種白血病細(xì)胞系的增值。目前關(guān)于TCS與卵巢癌關(guān)系的研究報(bào)道極少。本組資料顯示,天花粉蛋白從50μg/ml濃度開始對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR3表現(xiàn)出抑制作用,而且濃度越高,抑制作用越強(qiáng),1 000μg/ml時(shí),抑制作用達(dá)到58.65%。體外實(shí)驗(yàn)表明天花粉蛋白對(duì)卵巢癌具有抗腫瘤作用。

    目前對(duì)天花粉蛋白抗癌機(jī)制的研究并不很深入,主要集中于以下幾方面:抑制腫瘤細(xì)胞增殖,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡;抑制腫瘤細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成;促進(jìn)NK細(xì)胞活性,提高機(jī)體免疫力;提高紅細(xì)胞免疫黏附功能,增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞抗原性,從而增強(qiáng)抗癌免疫反應(yīng)等[7-9]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)天花粉蛋白能明顯下調(diào)OVCAR3細(xì)胞HLA-GmRNA表達(dá)水平,而且1 000μg/ml組中HLA-G光密度值顯著低于500μg/m l組??乖较抡{(diào)和藥物濃度有關(guān),濃度越高,抗原水平越低。因此為天花粉蛋白的抗腫瘤機(jī)制提供了另一種可能途徑,即通過下調(diào)人類白細(xì)胞抗原HLA-G、HLA-E水平,解除其與NK細(xì)胞、細(xì)胞毒性T細(xì)胞抑制型受體結(jié)合,從而恢復(fù)免疫細(xì)胞的殺瘤作用而實(shí)現(xiàn)的。這為天花粉蛋白的開發(fā)和臨床應(yīng)用提供了有力的依據(jù)。

    抗孕激素米非司酮(RU486,mifepristone)由法國(guó)Roussel-Uclaf公司于1980年最先合成,作為一種抗早孕藥物在臨床被推廣使用。米非司酮臨床應(yīng)用領(lǐng)域不斷拓寬,并在婦科腫瘤及其他腫瘤如子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、卵巢癌、腦膜瘤、胃癌治療等方面進(jìn)行探索性應(yīng)用[10-12]。本實(shí)驗(yàn)顯示米非司酮對(duì)卵巢癌細(xì)胞系OVCAR3表現(xiàn)出濃度依賴性的抑制作用,表明米非司酮對(duì)卵巢癌有較強(qiáng)抗腫瘤作用。目前米非司酮治療卵巢癌作用機(jī)理研究主要局限于拮抗孕激素這一機(jī)制,其他方面的報(bào)道極少。本組資料中,通過對(duì)卵巢癌細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究,我們首先得出結(jié)果米非司酮對(duì)卵巢癌細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用,然后通過RT-PCR方法基因轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)發(fā)現(xiàn)米非司酮能明顯下調(diào)OVCAR3細(xì)胞HLA-G基因mRNA表達(dá)水平,同樣從腫瘤免疫逃逸機(jī)制方面闡明了米非司酮抗腫瘤作用的另一機(jī)制,即下調(diào)非經(jīng)典白細(xì)胞抗原HLA-G,阻斷他們同免疫細(xì)胞抑制性受體的結(jié)合,恢復(fù)免疫細(xì)胞的活性,達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的目的。

    做為治療卵巢癌最常用的化療藥物,順鉑作用機(jī)制主要是攻擊DNA堿基的氮原子,與DNA形成交叉連結(jié),使DNA的模板作用失活,因而可抑制DNA合成。本研究中順鉑對(duì)卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中HLA-G抗原mRNA表達(dá)無明顯影響。研究結(jié)果表明順鉑做為最重要的治療卵巢癌藥物,作用機(jī)制方面可能沒有參與解除HLA-G誘導(dǎo)的腫瘤免疫逃逸過程。天花粉蛋白和米非司酮治療卵巢癌的作用機(jī)制同順鉑有所不同,與順鉑聯(lián)合應(yīng)用,可能會(huì)取得更好的治療效果,為進(jìn)一步動(dòng)物移植瘤模型觀察藥物療效提供可行性依據(jù)[13],從而為臨床制定合理的化療方案提供依據(jù)。

    1 朱衛(wèi)紅,魏國(guó)華,孫進(jìn).天花粉蛋白羊膜腔注射配伍米百司酮用于高危中期妊娠引產(chǎn)的療效分析.中國(guó)全科醫(yī)學(xué),2009,26:1006-1007.

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