側(cè)孢芽孢桿菌2-Q-9菌株外泌抗菌肽的純化與鑒定

陳武，彭曙光，周清明，黎定軍，羅寬

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) a.作物學(xué)博士后流動(dòng)站；b.生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙410128；2.湖南省煙草公司 煙葉處，湖南 長(zhǎng)沙410007； 3.中國(guó)煙草中南農(nóng)業(yè)試驗(yàn)站，湖南 長(zhǎng)沙410128；4.湖南廣播電視大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410004）

針對(duì)青枯病菌的生物防治主要包括利用無(wú)致病力青枯菌預(yù)先接種植物和利用芽孢桿菌、假單胞桿菌、鏈霉菌等與青枯病菌競(jìng)爭(zhēng)生長(zhǎng)位點(diǎn)或抑制青枯病菌的生長(zhǎng)。芽孢桿菌具有很強(qiáng)的抗逆和抗菌、防病能力，可分泌種類豐富的抗菌肽、抗生素或抗菌蛋白[1-2]。依據(jù)合成途徑的不同，可將抗菌肽和抗菌蛋白分為核糖體合成和非核糖體合成兩類[3-6]，已有一些抗菌肽或抗菌蛋白在農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用[7]。

從湖南省茄科作物青枯病發(fā)病較重地區(qū)的土壤中分離得到1株側(cè)孢芽孢桿菌（Bacillus laterospours）菌株2-Q-9，平板拮抗試驗(yàn)證明，2-Q-9對(duì)青枯病菌的3個(gè)生理小種均有強(qiáng)烈的抑制作用[8]；2005年在湖南省3個(gè)煙草青枯病高發(fā)區(qū)的大田試驗(yàn)結(jié)果表明，它對(duì)煙草青枯病的防治效果達(dá)65%。菌株2-Q-9的發(fā)酵培養(yǎng)條件得到優(yōu)化[9]，初步分析了抑菌物質(zhì)的理化性質(zhì)[8]，研究了它對(duì)煙草幼苗根系活力的影響[10]。筆者通過(guò)乙醇沉淀、高效液相色譜層析、Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析及質(zhì)譜測(cè)序等方法，純化并鑒定了2-Q-9外泌抗菌肽BL2Q9。

1 材料與方法

1.1 材 料

側(cè)孢芽孢桿菌菌株 2-Q-9為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)生物安全科學(xué)技術(shù)學(xué)院植物病理研究室篩選保存；青枯病菌菌株P(guān)O41為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所馮蘭香研究員惠贈(zèng)。拮抗菌和青枯病菌菌株的培養(yǎng)及平皿拮抗試驗(yàn)均參照文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行。

1.2 方 法

1.2.1 拮抗菌外泌蛋白質(zhì)組粗提液的制備

挑取在NB固體培養(yǎng)基劃線活化的2-Q-9單菌落，接種于含40 mL NB液體培養(yǎng)基的250 mL 三角瓶中過(guò)夜培養(yǎng)．第2天分別取10 mL新鮮培養(yǎng)的菌液接種于2個(gè)含 400 mL NB液體培養(yǎng)基的1 L三角瓶中，250 r/min、28 ℃、24 h后離心取上清液。以下操作若非特別注明，均在4 ℃下進(jìn)行。

1份上清液中加入預(yù)冷至0 ℃的無(wú)水乙醇至終體積分?jǐn)?shù)為75%，磁力攪拌子緩慢攪拌10 min后，靜置40 min。收集所有溶液于13 000 r/m離心10 min，棄上清；沉淀用2 mL 70%乙醇漂洗，再在13 000 r/m離心10 min，吸干上清，待乙醇完全揮發(fā)后，用2 mL pH 8.0 的20 m mol/L Tris-HCl溶液溶解，得外泌蛋白粗提溶液，－20 ℃短期保存或真空冷凍干燥后，置－80 ℃長(zhǎng)期保存。

另1份上清液中加入硫酸銨直至飽和后靜置2 h，其余操作同上。

1） 陰離子交換柱處理。先用50 mmol/L pH8.0的Tris-HCl溶液平衡陰離子交換柱至少5倍柱床體積，當(dāng)紫外吸收值為0時(shí)，取1 mL經(jīng)乙醇沉淀的蛋白質(zhì)組粗提液上柱，分別收集各穿透峰；當(dāng)紫外吸收值恢復(fù)到0時(shí)用KCl溶液梯度洗脫，KCl梯度區(qū)間為0～2 mol/L，梯度為10%。分別收集各濃度梯度下的洗脫峰，取40 μL與青枯病菌拮抗培養(yǎng)，另各取適量穿透峰和洗脫峰經(jīng)脫鹽柱脫鹽后, 用SDS- PAGE凝膠電泳檢測(cè)。

2） 陽(yáng)離子交換柱處理。用20 mmol/L磷酸緩沖液平衡陽(yáng)離子交換柱至紫外吸收值為0時(shí)待用。將有抑菌活性的穿透峰經(jīng)脫鹽柱脫鹽后上已預(yù)平衡的陽(yáng)離子交換柱，每次上樣量為1 mL。用KCl梯度洗脫，梯度區(qū)間為0～1 mol/L，梯度為10%。收集洗脫峰和穿透峰凝膠電泳檢測(cè)，同時(shí)進(jìn)行平板拮抗試驗(yàn)。

1.2.2 抗菌肽的分離純化

抗菌肽的分離純化使用Amersham Biosciences公司的AKTATMFPLCTM[Monitor UPC-900；Pump P-920；Frac-900]系統(tǒng)。

1.2.3 SDS-PAGE電泳分析

采用常規(guī)凝膠電泳分析 2-Q-9的外泌蛋白質(zhì)組（乙醇粗提液）；小分子量多肽的電泳分析使用Tricine-SDS-PAGE[11]。

1.2.4 等電點(diǎn)測(cè)定

使用Pharmacia公司pH為9.0～1.0的兩性電解質(zhì)測(cè)定抗菌肽等電點(diǎn)。凝膠配制參照文獻(xiàn)[12]。

1.2.5 抗菌肽N端Edman降解測(cè)序和串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序

抗菌肽Tricine-SDS-PAGE電泳后，用Bio-Rad半干轉(zhuǎn)膜儀將蛋白條帶轉(zhuǎn)至 Bio-Rad測(cè)序?qū)Ｓ肞VDF膜上，送中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)分析中心測(cè)序。

采用對(duì)小分子質(zhì)量蛋白（肽）分辨率更高的Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分離抗菌肽，切取目的條帶送北京市生命科學(xué)研究所進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序。所得譜圖用MASCOT“MS/MS Ion Search”模式在數(shù)據(jù)庫(kù)NCBInr內(nèi)搜索。

2 結(jié)果與分析

2.1 拮抗菌外泌抗菌肽抑菌活性

用硫酸銨沉淀的方法，得到拮抗菌外泌蛋白質(zhì)組粗提液（圖 1-1）及上清（圖 1-2），分別與青枯病菌拮抗培養(yǎng)，均未觀察到抑菌圈。這說(shuō)明硫酸銨可能破壞了外泌抗菌肽的抑菌活性。乙醇沉淀的蛋白質(zhì)組粗提液經(jīng)50 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸后表現(xiàn)出強(qiáng)烈的抑菌活性（圖1-3），而上清液無(wú)抑菌活性（圖 1-4），這說(shuō)明外泌抗菌肽在 75%的乙醇溶液中被完全沉淀，它的抑菌活性未受到破壞。

圖1 兩種沉淀方法對(duì)抗菌肽活性的影響Fig. 1 Pattern of activity of antibiotic peptide precipitated by （NH4）2SO4 and ethanol

2.2 2-Q-9外泌抗菌肽的相對(duì)分子質(zhì)量

分別收集經(jīng)過(guò)陰離子交換柱的穿透峰和不同濃度KCl洗脫的洗脫峰與青枯病菌平板拮抗培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)抑菌活性物質(zhì)存在于穿透峰，未被陰離子柱吸附，說(shuō)明該抑菌物質(zhì)在pH為8.0時(shí)帶正電荷或不帶電荷，其等電點(diǎn)高于或等于8.0。將收集的穿透峰再過(guò)陽(yáng)離子交換柱，在KCl為0.20～0.29 mol/L出現(xiàn)1個(gè)洗脫峰，將洗脫峰與青枯病菌拮抗培養(yǎng)，表現(xiàn)出明顯抑菌效果?？咕慕?jīng)脫鹽柱脫鹽并冷凍干燥后用Tricine-SDS-PAGE凝膠電泳分析其組分及相對(duì)分子質(zhì)量，結(jié)果表明，該洗脫峰中只含單一的肽，其相對(duì)分子質(zhì)量約為7 800。將該抗菌肽命名為BL2Q9。

BL2Q9在變性凝膠Tricine-SDS-PAGE上為2條帶，但在非變性醋酸-PAGE凝膠上為單一條帶，推測(cè)該抗菌肽可能是由2個(gè)亞基組成的二聚體，當(dāng)SDS存在時(shí)抗菌肽變性，解離成2個(gè)小肽（圖2）。

2.3 抗菌肽BL2Q9的電荷屬性

陰離子交換色譜層析時(shí)，抗菌肽未能被經(jīng)pH8.0 的 50 mmol/L Tris-HCl平衡的陰離子柱吸附；在之前的試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，抗菌肽在pH 分別為9.0、10.0和11.1時(shí)性質(zhì)最穩(wěn)定，對(duì)青枯病菌的抑制效果最好[8]。據(jù)此推測(cè)，抗菌肽的等電點(diǎn)高于8.0，因此選用pH為9.0～11.0的等電聚焦凝膠檢測(cè)抗菌肽的等電點(diǎn)，結(jié)果表明，其等電點(diǎn)為10.2。根據(jù)以上結(jié)論，推測(cè)BL2Q9在生理pH 條件下帶正電荷，結(jié)合到攜帶大量負(fù)電荷的青枯菌的細(xì)胞膜上，形成孔洞或破壞細(xì)胞膜的完整性，使細(xì)胞內(nèi)含物外滲，導(dǎo)致青枯病菌菌體死亡，Brodgen總結(jié)了這類抗菌肽詳細(xì)的作用機(jī)理[4]。

圖2 抗菌肽BL2Q9的凝膠電泳結(jié)果Fig. 2 Gel patterns of aantibiotic peptide BL2Q9

2.4 N端Edman降解測(cè)序結(jié)果

對(duì)抗菌肽進(jìn)行N端Edman降解測(cè)序，發(fā)現(xiàn)抗菌肽N端封閉，嘗試對(duì)其進(jìn)行去封閉化處理，但未獲成功。外泌蛋白/肽的末端封閉是生物在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種自我保護(hù)機(jī)制，可以避免外泌蛋白的快速降解。外泌抗菌肽或蛋白N末端修飾的機(jī)制非常復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)200多種可能的末端修飾方式[13]。由于無(wú)法準(zhǔn)確地判斷抗菌肽BL2Q9的N端封閉類型，轉(zhuǎn)而采用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）分析抗菌肽的氨基酸序列（表 1）。MS/MS 測(cè)序結(jié)果表明，BL2Q9與pilQ 的前體蛋白及轉(zhuǎn)錄抑制蛋白CodY的部分序列相同，Mascot程序給出的分值分別為59和58，與其他 3個(gè)蛋白的相似性稍低，分值分別為 57、54和51。對(duì)5個(gè)匹配氨基酸序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)性質(zhì)為極性正電荷的氨基酸（K，R和H）明顯多于極性負(fù)電荷的（D和 E），肽鏈的整體電荷屬性為正電荷，這也與前期的試驗(yàn)結(jié)果及預(yù)測(cè)相符。

表1 抗菌肽的串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)序Table 1 MS/MS sequence results of antimicrobial peptide BL2Q9

3 討 論

芽孢桿菌能產(chǎn)生種類豐富的包括抗生素和抗菌肽在內(nèi)的抗菌物質(zhì)[14]?？股氐淖饔脵C(jī)理主要是破壞代謝過(guò)程，其作用靶標(biāo)多為代謝過(guò)程中的酶，容易誘導(dǎo)選擇性抗性的產(chǎn)生[15]；抗菌肽的主要作用機(jī)理是破壞靶標(biāo)生物的細(xì)胞膜，不易產(chǎn)生誘導(dǎo)性抗性[16-17]，因而抗菌肽具有更好的開(kāi)發(fā)與利用前景。目前這些多肽或其制劑已被廣泛應(yīng)用于抗真菌、抗病毒、抗阿米巴細(xì)胞和抗支原體等生物制藥及臨床應(yīng)用[18-19]。通過(guò)分離純化芽孢桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物，得到了一些拮抗植物病原菌的抗菌蛋白和低分子質(zhì)量的抗菌多肽，并進(jìn)行了一些氨基酸序列測(cè)定，在此基礎(chǔ)上，一些抗菌蛋白或抗菌肽的編碼基因已被克隆，為作物抗病基因工程提供了有潛在應(yīng)用價(jià)值的基因資源[20-21]。

筆者發(fā)現(xiàn)經(jīng)乙醇沉淀的 BL2Q9的抑菌活性未受影響，但硫酸銨沉淀的抗菌肽的抑菌活性幾乎喪失，推測(cè)可能是硫酸銨中痕量的金屬離子與BL2Q9互作，破壞了其抑菌能力，或者是因?yàn)楦邼舛鹊牧蛩徜@破壞了 BL2Q9的構(gòu)象。對(duì)于微生物分泌至體外的抗菌肽，可以嘗試有機(jī)溶劑沉淀、硫酸銨沉淀和等電點(diǎn)沉淀等，以選擇沉淀效率高、活性損失少的方法。

分離的抗菌肽先后經(jīng)陰離子和陽(yáng)離子親和柱純化后，利用凝膠電泳鑒定其相對(duì)分子質(zhì)量為7 800，利用等電聚焦電泳確定BL2Q9等電點(diǎn)為10.2. 串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）測(cè)序結(jié)果表明，肽鏈中性質(zhì)為極性正電荷的氨基酸明顯多于極性負(fù)電荷的，肽鏈的整體電荷屬性為正電荷。與數(shù)據(jù)庫(kù)中的蛋白質(zhì)比對(duì)結(jié)果表明，BL2Q9與已知抗菌肽的序列相似性較低，可能為一種新的抗菌肽。目前已經(jīng)報(bào)道的被分離鑒定的抗菌肽有1 628種，通過(guò)對(duì)已知抗菌肽的比對(duì)分析（http://aps.unmc.edu/AP/），發(fā)現(xiàn)抗菌肽之間的序列相似性很低。對(duì)于決定抗菌肽活性的關(guān)鍵因子又有新的假設(shè)被提出，即抗菌肽的抑菌活性并非由其特定的氨基酸序列決定，而是由其氨基酸組成及理化特性所決定[22]，這一假說(shuō)對(duì)抗菌肽研究有現(xiàn)實(shí)的指導(dǎo)價(jià)值。

筆者將根據(jù)MS/MS測(cè)序的結(jié)果設(shè)計(jì)PCR簡(jiǎn)并引物，以克隆該抗菌肽的編碼基因并分析其調(diào)控機(jī)理，為對(duì)拮抗菌2-Q-9進(jìn)行遺傳改良并利用BL2Q9的編碼基因進(jìn)行抗病分子育種奠定基礎(chǔ)。

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英文編輯：易來(lái)賓