診斷抗原的純化在牛γ-干擾素ELISA法中的應(yīng)用

邱美珍，周望平，肖兵南，杜麗飛，胡述光，劉毅，陳江

（1.湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410131；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

目前，牛結(jié)核病的早期臨床診斷仍以皮內(nèi)變態(tài) 反應(yīng)（TST）為主，但其檢測(cè)的敏感性和特異性不高。隨著免疫機(jī)理研究的深入，建立了牛 γ-干擾素ELISA診斷法（IFN-γ-ELISA），在國外已通過臨床試驗(yàn)，證實(shí)了用該法診斷牛結(jié)核病的可靠性[1]。大量研究[2-8]表明，特異性診斷抗原影響IFN-γ-ELISA診斷的靈敏度。Amadori等[2]運(yùn)用分子生物學(xué)手段，制備了特異性診斷抗原，使得IFN-γ-ELISA診斷的特異性有所提升。有研究[8]發(fā)現(xiàn)，特異性抗原CFP10/ESAT6誘導(dǎo)的IFN-γ釋放反應(yīng)的靈敏度略低于PPD誘導(dǎo)的IFN-γ釋放反應(yīng)。筆者通過親和層析純化牛結(jié)核菌純蛋白衍生物（PPD）抗原，并制備兔抗草分支桿菌抗體，將其偶聯(lián)到CNBr活化的凝膠上，探討牛結(jié)核病的IFN-γ-ELISA診斷?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材 料

（1） 樣品。無菌采集長(zhǎng)沙某養(yǎng)殖場(chǎng)60份奶牛血。

（2） 菌種與試劑。草分支桿菌購自中國科學(xué)院微生物研究所（菌種編號(hào)為 4.1180）；牛 γ-干擾素（IFN-γ）ELISA 試劑盒購自ADL公司；溴化氰活化的凝膠（CNBr-Sepharose 4B）購自法馬西亞公司；牛PPD和禽PPD均購自黑龍江省生物制品一廠。

1.2 方 法

1.2.1 診斷抗原、抗體的制備

1） 草分支桿菌菌體抗原的制備。將草分支桿菌培養(yǎng)后，離心，收集菌泥。將菌泥充分研磨，稀釋，靜置過夜，將上層液體配成OD525nm為0.4的混懸液。

2） 兔抗草分支桿菌抗體的制備。選取 2只2.0～2.5 kg的健康公兔，在其皮下多點(diǎn)多次注射草分支桿菌進(jìn)行免疫。每次免疫后于耳靜脈采血，收集血清，待試管凝集價(jià)達(dá)1∶800以上時(shí)將兔處死，采血并分離血清。血清用飽和硫酸銨提純。用Bradford法[9]測(cè)定血清抗體蛋白含量。

3） 親和抗原的制備[10-11]。取純化的兔抗草分支桿菌抗體約18 mg與1 g膠（CNBr-Sepharose 4B）混勻，室溫作用 2 h。離心后裝柱，過量的配基用偶聯(lián)緩沖液洗滌。收集全部未偶聯(lián)的蛋白，Bradford法[9]測(cè)定蛋白含量。加入封閉液，室溫下?lián)u勻2 h，棄上清，分別用pH4.0和pH8.0的緩沖液洗膠，洗3個(gè)循環(huán)。再用磷酸緩沖液（PBS）洗2次。測(cè)定最后1次洗滌液的OD280nm，使OD280nm＜0.02，保存于4℃?zhèn)溆?。加入PPD，上樣量3 mg。室溫感作30 min。以PBS沖洗，收集洗脫液，洗脫至OD280nm＜0.02。將所有蛋白洗脫管合并，所得即為PPD親和層析抗原。加pH2.4的Gly-HCl緩沖液，收集解吸下來的成分，立即以NaHCO3中和。用Bradford法[9]測(cè)定蛋白含量。

1.2.2 牛結(jié)核病的檢測(cè)方法

1） 皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）檢測(cè)。按常規(guī)方法[10]對(duì)60頭奶牛進(jìn)行檢測(cè)。參照文獻(xiàn)[12]，僅用牛型 PPD在牛頸部進(jìn)行變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)。劑量為2 000 IU。注射前測(cè)量皮膚厚度，注射后 72 h再次測(cè)定皮膚厚度，皮厚差大于3 mm時(shí)判為牛結(jié)核病陽性，反之為牛結(jié)核病陰性。

2） 抗酸染色檢測(cè)。按照常規(guī)方法[10]對(duì)60份奶牛血清進(jìn)行檢測(cè)。

3） 牛結(jié)核ELISA（PPD-ELISA）法檢測(cè)。首先，參照1.2.1（1）制備草分支桿菌吸收抗原，簡(jiǎn)稱草吸抗原。其次，用草吸抗原處理血清：對(duì) 60份奶牛血檢測(cè)，取血清100 μL，分別加入草吸抗原100 μL，PBS 800 μL，37 ℃感作1 h；再取上清液100 μL，加入700 μL PBST，混勻后取100 μL加入到檢測(cè)孔。其他步驟按試劑盒操作程序進(jìn)行。

4） IFN-γ-ELISA 法檢測(cè)[13]。對(duì)60份奶牛血進(jìn)行檢測(cè)，無菌采血，肝素抗凝。采血后8 h內(nèi)檢測(cè)。檢測(cè)步驟按照試劑盒操作程序進(jìn)行。

5） 用親和層析抗原IFN-γ-ELISA 法檢測(cè)。對(duì)TST法檢測(cè)有疑問的奶牛血重新進(jìn)行檢測(cè)，無菌采血，肝素抗凝。采血后8 h內(nèi)檢測(cè)。將每份檢測(cè)血分為3份，分別加入禽PPD、未純化牛PPD、親和層析純化的牛PPD，然后在CO2（5%）培養(yǎng)箱37 ℃孵育18 h，離心獲得的血漿用于試驗(yàn)。以PBS為對(duì)照。其他步驟按照試劑盒操作程序進(jìn)行。

1.2.3 結(jié)果判定

牛γ-干擾素陰性對(duì)照OD值＜0.130，牛γ-干擾素陽性對(duì)照OD值＞0.700方可用。陰性對(duì)照重復(fù)孔差值不能大于0.040[14]。

敏感性＝真陽性數(shù)/（真陽性數(shù)＋假陰性數(shù)）。

特異性＝真陰性數(shù)/（真陰性數(shù)＋假陽性數(shù)）。

符合率＝（真陽性數(shù)＋真陰性數(shù)）/被檢總數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔抗草分支桿菌抗體的偶聯(lián)率與親和層析結(jié)果

加入待偶聯(lián)的蛋白共18 mg，收集到未偶聯(lián)的蛋白共約3 mg，偶聯(lián)率為83.3%。親和層析結(jié)果表明，第1次洗脫下來的成分主要是特異性的牛結(jié)核PPD抗原；第2次解吸附下來的成分主要是被兔抗草分支桿菌抗體吸附的抗原，是非特異性的成分，用Bradford法測(cè)得第1次洗脫和第2次解吸附的蛋白總量分別為2.6、0.4 mg。

2.2 4種方法對(duì)牛結(jié)核病的檢測(cè)結(jié)果

4種方法對(duì)60頭牛結(jié)核病的檢測(cè)結(jié)果為：TST檢測(cè)出陽性3例，陰性44例，疑似15例；抗酸染色法檢出陽性6例，陰性54例；PPD-ELISA法檢出陽性7例，陰性51例，疑似2例；IFN-γ-ELISA法檢出陽性6例，陰性54例。可見，陽性檢出率最高是PPD-ELISA法，為11.6%，最低的是TST法，為5%；疑似檢出率最高的是TST法，為21.6%，其次是 PPD-ELISA法；抗酸染色和 IFN-γ-ELISA法沒有疑似病例。

2.3 4種方法的檢測(cè)敏感性、特異性和符合率

表1結(jié)果表明，與抗酸染色相比，IFN-γ-ELISA法的敏感性、特異性和符合率都比較高；TST法的敏感性和特異性為 100%，但符合率比較低，主要是因?yàn)橐伤撇±^多；PPD-ELISA的敏感性較低，也存在疑似病例。

表1 4種檢測(cè)方法的敏感性、特異性和符合率Table 1 Sensitivity, specificity, consistency of detection results by four tests %

2.4 3種抗原刺激的ⅠFN-?-ELⅠSA檢測(cè)結(jié)果

世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）推薦使用牛 PPD、禽PPD比較IFN-γ釋放反應(yīng)，以排除環(huán)境分支桿菌對(duì)牛結(jié)核診斷的干擾.本試驗(yàn)中使用牛/禽結(jié)核菌素比較反應(yīng)（包括皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)和 IFN-γ釋放反應(yīng)），發(fā)現(xiàn)1例抗酸染色陽性的牛（表2），親和層析抗原純化PPD（牛PPD’）的IFN-γ-ELISA檢測(cè)OD值為0.166，判為陰性；未經(jīng)親和層析處理PPD的IFN-γ-ELISA檢測(cè)OD值為0.385，判為陽性，這證明PPD中的非特異成分，經(jīng)親和層析后被吸附，從而排除了環(huán)境分支桿菌對(duì)試驗(yàn)的干擾。雖然本試驗(yàn)中可以用禽PPD刺激IFN-γ釋放反應(yīng)作為對(duì)照來排除環(huán)境分支桿菌對(duì)試驗(yàn)的影響，但是，如果發(fā)生牛和禽結(jié)核或其他環(huán)境分支桿菌的同時(shí)感染時(shí)，親和層析抗原刺激的IFN-γ釋放反應(yīng)就具有很大的優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與抗酸染色相比，IFN-γ-ELISA的特異性、符合率較高，達(dá) 90%以上，敏感性也達(dá)到了83.33%。該方法有望替代TST法[15-19]在中國推廣使用。

結(jié)核分支桿菌屬于胞內(nèi)寄生菌，在機(jī)體發(fā)生免疫的過程中，初期是誘發(fā)細(xì)胞免疫，并釋放出各種細(xì)胞因子。IFN-γ是結(jié)核菌感染時(shí)誘導(dǎo)的主要細(xì)胞因子[11-12]，因而，檢測(cè)結(jié)核菌特異抗原誘導(dǎo)的 IFN-γ釋放反應(yīng)具有較高的靈敏度與特異性[20]。牛結(jié)核 γ-干擾素診斷依據(jù)是T淋巴細(xì)胞釋放的γ-干擾素水平，因此，能在結(jié)核病早期作出診斷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，與IFN-γ-ELISA、PPD-ELISA和抗酸染色法相比，TST法有著本身固有的缺陷：操作和結(jié)果判斷主觀，非特異性反應(yīng)現(xiàn)象常見，疑似病例較多。PPD-ELISA的敏感性較低，也存在疑似病例?？顾崛旧o法區(qū)分死菌和活菌，結(jié)果受試驗(yàn)條件和檢驗(yàn)人員鏡檢技術(shù)水平的影響較大，靈敏度低（通常需要5 000～10 000個(gè)/mL抗酸桿菌才能得到陽性結(jié)果），特異性差（各種抗酸桿菌均可著色，需通過進(jìn)一步試驗(yàn)才能確定是否為結(jié)核菌）[16-18]，而IFN-γ-ELISA法的敏感性、特異性和符合率都比較高。

牛感染結(jié)核桿菌與環(huán)境分支桿菌可以分為以下3種情況：只感染牛結(jié)核菌，只感染環(huán)境分支桿菌，同時(shí)感染牛結(jié)核菌與環(huán)境分支桿菌。在前2種情況下，牛/禽結(jié)核菌素比較反應(yīng)值與牛結(jié)核菌感染呈正相關(guān)，即比較反應(yīng)結(jié)果為正值時(shí)表示牛結(jié)核菌感染，比較結(jié)果為負(fù)值時(shí)為環(huán)境分支桿菌感染；后一種情況，IFN-γ比較釋放反應(yīng)值與牛結(jié)核菌感染實(shí)際情況嚴(yán)重不符?；旌细腥緯r(shí)，牛/禽PPD的IFN-γ比較釋放反應(yīng)靈敏度低，準(zhǔn)確度差，陰性牛被判為假陽性。相比之下，親和層析抗原被吸附掉草分支桿菌及類屬抗原成分，所誘導(dǎo)的IFN-γ釋放反應(yīng)很大程度降低了環(huán)境分支桿菌感染的影響，親和抗原誘導(dǎo)的IFN-γ釋放水平不比牛PPD低，所以，該反應(yīng)具有很高的靈敏度與特異性。

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英文編輯：羅文翠