1株產(chǎn)α-半乳糖苷酶乳球菌的分離鑒定及酶學(xué)特性

周晶輝，胡超，劉曉柱，彭珍子，張學(xué)文

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128）

α-半乳糖苷酶（α-galactosidase, EC3.2.1.22）能夠特異性水解α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的碳水化合物[1-2]。α-半乳糖苷酶作為酶制劑添加到豆類飼料中，可以降解半乳糖苷寡糖類抗?fàn)I養(yǎng)因子，有效減少腸道疾病的發(fā)生[3-5]。目前，普通α-半乳糖苷酶制劑難于滿足飼料用酶制劑對(duì)耐熱性和耐酸性的特殊要求，因此，研發(fā)飼用型α-半乳糖苷酶具有很好的市場(chǎng)前景。

筆者以湖南湘西地區(qū)富含豆粕的土壤為材料，篩選獲得1株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的細(xì)菌，經(jīng)顯微觀察及基于16S rDNA的序列分析，初步判定細(xì)菌種屬，并結(jié)合液體發(fā)酵培養(yǎng)對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了初步研究。

1 材料與方法

1.1 材 料

采集湘西某豆腐店周圍富含豆粕下腳料的土壤樣品，封存于無(wú)菌塑料袋中，4 ℃保存，用于制備土壤懸液。初篩培養(yǎng)基[6]：酵母提取物5 g，胰化蛋白胨 10 g，氯化鈉 10 g，瓊脂粉 15 g，蒸餾水1 000 mL，調(diào)pH值為7.0，121℃滅菌20 min。復(fù)篩培養(yǎng)基：酵母提取物5 g，胰化蛋白胨 10 g，氯化鈉 5 g，棉籽糖 2.5 g， 調(diào)pH值為7.0， 121 ℃滅菌20 min。

1.2 方 法

1.2.1 菌株篩選

土壤樣品制成 10－4、10－5、10－6梯度的土壤菌懸液，分別涂布于初篩培養(yǎng)基（90 mm平板添加50 μL 2 mg/mL X-α-gal），37 ℃培養(yǎng)48 h，篩選呈藍(lán)色的菌落[7]。復(fù)篩結(jié)合液體發(fā)酵培養(yǎng)，選擇酶活較高的菌株，劃線純化，顯微鏡檢查純度，得菌株純培養(yǎng)物。

1.2.2 純化菌株顯微形態(tài)及基于16S rDNA的分子鑒定

純化菌株革蘭氏染色，顯微形態(tài)觀察，采用CTAB/NaCl方法[8]提取細(xì)菌全基因組DNA，以細(xì)菌16S rDNA通用上游引物 5′-AGAGTTTGATCCTG GCTCAG-3′和下游引物5′-ACGGTTACCTTGTTAC GACTT-3′擴(kuò)增純化菌株16S rDNA基因片段，測(cè)序由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司完成。根據(jù)測(cè)序結(jié)果，用Blast程序與GenBank上已經(jīng)登錄的菌株16S rDNA序列進(jìn)行比對(duì)，分析比對(duì)結(jié)果。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作及酶活的測(cè)定

以不同濃度的對(duì)硝基酚為底物，在OD405nm處進(jìn)行測(cè)定并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9]。采用對(duì)硝基酚-α-D-吡喃半乳糖（P-PNG）法[10-12]對(duì)菌株分泌的α-半乳糖苷酶的酶活進(jìn)行測(cè)定。酶活單位定義為：在pH 4.0、37 ℃條件下，每分鐘分解底物生成1 μmol對(duì)硝基酚所需要的酶量為1個(gè)α-半乳糖苷酶酶活單位。

1.2.4 pH和溫度對(duì)α-半乳糖苷酶活性的影響

采用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖體系配制pH分別為2.6、3.0、3.6、4.0、4.4、5.2、5.6、6.0、6.6、7.2、8.0的緩沖液，測(cè)定酶活力，以酶活力最高者定為100%，以相對(duì)酶活力對(duì)所對(duì)應(yīng)的pH值作圖；將酶液與最適宜pH值的磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液分別在20、25、30、35、40、50、55、60、65、70、75、80 ℃水浴1 h，測(cè)定酶活力，得到酶液在不同反應(yīng)溫度下的酶活力，以酶活力最高者定為100%，以相對(duì)酶活力對(duì)溫度作圖。

1.2.5 細(xì)菌酶基因表達(dá)調(diào)控分析

收集不同濃度棉籽糖誘導(dǎo)下的發(fā)酵液上清 1 mL，各取200 μL分別置于酶標(biāo)板的加樣孔中，加入20 μL 2 mg/mL 的X-α-gal溶液，同時(shí)以液體發(fā)酵培養(yǎng)基作為空白對(duì)照，37 ℃溫浴12 h后, 置于4℃冰箱充分顯色，觀察不同濃度棉籽糖誘導(dǎo)下顯色情況。

1.2.6 葡萄糖和棉籽糖濃度對(duì)菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的影響

挑取單菌落接種于不同濃度的葡萄糖和棉籽糖的液體培養(yǎng)基中，葡萄糖及棉籽糖的濃度分別設(shè)置為10、20、30、40，50 μmol/mL，37 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，在最適pH值和溫度的條件下，分析葡萄糖和棉籽糖濃度對(duì)菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶的活性影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選及顯微形態(tài)鑒定

通過(guò)添加 X-α-gal顯色底物的篩選培養(yǎng)基培養(yǎng)，結(jié)合液體發(fā)酵培養(yǎng)基篩選，得到了1株產(chǎn)α-半乳糖苷酶細(xì)菌，肉眼觀察細(xì)菌菌落邊緣規(guī)則，微隆起，表面濕潤(rùn)，用革蘭氏染色，分離菌株在顯微鏡下觀察，結(jié)果，分離菌株呈現(xiàn)紫色，為革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌，細(xì)胞為球形。

2.2 細(xì)菌的16S rDNA克隆測(cè)序與菌種鑒定

圖1 分離菌株16S rDNA PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 16S rDNA PCR product of screened strain

在分離細(xì)菌基因組DNA后，以16S rDNA的通用引物進(jìn)行該基因的PCR擴(kuò)增，重復(fù)的擴(kuò)增都得到了大小確定的分子（圖1），擴(kuò)增分子克隆到T-載體并測(cè)序，序列用BLAST程序與GenBank中已經(jīng)登錄的16S rDNA進(jìn)行核苷酸序列同源性比較，發(fā)現(xiàn)其與乳球菌16S rDNA同源性達(dá)98%，可以判定分離細(xì)菌為乳球菌屬細(xì)菌。

2.3 粗酶活測(cè)定結(jié)果

以不同濃度的對(duì)硝基酚在405 nm處吸光度平均值為x軸，以對(duì)硝基酚的濃度為y軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），用Excel辦公軟件作圖，得公式y(tǒng)=53.314x+ 0.212 8，其中R2=0.996 8。

圖2 對(duì)硝基酚OD405的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of p-nitrophenol

取搖瓶發(fā)酵上清液 1 mL加入pH 4.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液2 mL中，37 ℃預(yù)熱5 min后與1 mL10 mmol/L的PNPG底物反應(yīng)10 min，用6 mL 0.2 mol/L NaCO3終止反應(yīng)，分光光度計(jì)測(cè)定405 nm處吸光度值，同時(shí)設(shè)置對(duì)照管，測(cè)得吸光度值為1.160，計(jì)算得發(fā)酵上清液酶活為6.21 U/mL。

2.4 pH及溫度對(duì)分離菌株分泌α-半乳糖苷酶活性的影響

圖3分析表明, pH約5.5時(shí)，所分離菌株分泌的α-半乳糖苷酶表現(xiàn)相對(duì)較高的酶活力；圖4表明在較低的溫度（20～40 ℃）范圍內(nèi)，相對(duì)酶活力隨著溫度的升高而增加，隨著溫度的升高，酶活力逐漸下降，其最適宜溫度為45 ℃左右。

圖3 不同pH條件下細(xì)菌α-半乳糖苷酶活性Fig.3 α-galactosidase activity of bacterium under different pH condition

圖4 不同溫度條件下細(xì)菌α-半乳糖苷酶活性Fig.4 α-galactosidase activity of bacterium under different temperature condition

2.5 棉籽糖誘導(dǎo)下的酶與底物作用的顯色反應(yīng)

通過(guò)以棉籽糖作底物和X-α-gal顯色的酶活性觀察，進(jìn)行酶表達(dá)誘導(dǎo)的分析。上清液顯色反應(yīng)結(jié)果表明，分離菌株分泌的α-半乳糖苷酶為胞外酶，能夠使X-α-gal分解產(chǎn)生藍(lán)色沉淀，從顯色反應(yīng)的程度來(lái)看，低濃度的D-棉籽糖對(duì)酶的分泌有誘導(dǎo)作用，當(dāng)棉籽糖的濃度為30 μmol/mL時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳，顯色反應(yīng)較為明顯。

2.6 棉籽糖和葡萄糖對(duì)菌株分泌α-半乳糖苷酶的影響

根據(jù)顯色反應(yīng)建立起酶活力的分析方法后，以不同濃度棉籽糖和葡萄糖分別對(duì)搖瓶發(fā)酵菌進(jìn)行處理，分析圖5可知，分離菌株產(chǎn)α-半乳糖苷酶受到棉籽糖的誘導(dǎo)和葡萄糖的抑制作用，當(dāng)棉籽糖的濃度約為30 μmol/mL時(shí)，誘導(dǎo)效果最佳，酶活性達(dá)到最高，隨著棉籽糖濃度的增加，其對(duì)α-半乳糖苷酶的誘導(dǎo)合成作用已不明顯；在較低葡萄糖濃度（0～20 μmol/mL）下，分離菌株合成α-半乳糖苷酶，隨著葡萄糖的濃度增加而呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，隨著葡萄糖濃度不斷升高，菌株合成α-半乳糖苷酶受到葡萄糖的抑制，酶活力逐漸下降。

圖5 不同棉籽糖和葡萄糖濃度下細(xì)菌產(chǎn)酶的活性Fig.5 α-galactosidase activity of bacterium under different concentrations of raffinose and glucose

3 討 論

微生物合成的α-半乳糖苷酶為誘導(dǎo)型酶，高濃度的葡萄糖對(duì)其合成具有抑制作用[10]，且不同種類的微生物合成α-半乳糖苷酶需要不同的誘導(dǎo)物。本研究結(jié)果表明，分離菌株合成α-半乳糖苷酶受棉籽糖的誘導(dǎo)，可能是α-半乳糖苷酶的合成受到相關(guān)操縱子的調(diào)控，各個(gè)基因獨(dú)立發(fā)揮作用，棉籽糖作為酶的作用底物時(shí)起誘導(dǎo)作用進(jìn)而提高菌體生長(zhǎng)量及酶的合成量；合成受到葡萄糖的抑制，可能是分離菌株存在葡萄糖效應(yīng)引起的，當(dāng)培養(yǎng)基中有葡萄糖存在時(shí)，菌株會(huì)優(yōu)先利用葡萄糖，葡萄糖的某種分解代謝物能降低生物體內(nèi) cAMP的水平，影響RNA聚合酶與啟動(dòng)子結(jié)合，以至轉(zhuǎn)錄作用不能進(jìn)行，抑制了產(chǎn)酶基因的表達(dá)，酶的合成處于本底表達(dá)水平。但葡萄糖在0～20 μmol/mL時(shí)對(duì)酶的產(chǎn)生具有正向作用，可能是低濃度葡萄糖有利于細(xì)菌的生長(zhǎng)，因而整體促進(jìn)了酶的產(chǎn)生。

對(duì)霉菌（青霉）、植物（咖啡豆）[13-14]等α-半乳糖苷酶的研究已取得重要進(jìn)展，諸多α-半乳糖苷酶基因已經(jīng)被克隆[15-16]。由于細(xì)菌來(lái)源的α-半乳糖苷酶為單肽酶，活性發(fā)揮不需要糖基化，結(jié)構(gòu)也更為簡(jiǎn)單，更利于操作，因此，借助于基因工程技術(shù)手段獲得酶活高、耐熱、耐酸性強(qiáng)的α-半乳糖苷酶成為研究熱點(diǎn)。本研究已分離和鑒定出產(chǎn)α-半乳糖苷酶細(xì)菌，將以這一菌株為出發(fā)菌株，進(jìn)行酶基因克隆和改造。

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英文編輯：易來(lái)賓