特比萘酚對白念珠菌Cahxt5缺失株表型的影響*

王 娟,周二鵬,賈鵬飛

(石家莊學(xué)院化工學(xué)院,河北石家莊050035)

白念珠菌(Candida albicans)是一種臨床常見的條件性致病真菌,正常生理?xiàng)l件下存在于健康畜禽及人的口腔、上呼吸道和腸道等處,很少出現(xiàn)臨床致病癥狀[1]。當(dāng)菌群失調(diào),免疫機(jī)能下降或者發(fā)生缺陷時,白念珠菌就會轉(zhuǎn)變成菌絲形態(tài),引發(fā)動物或人局部反復(fù)感染或者全身性系統(tǒng)感染[2]。在臨床上,主要引起禽類上消化道真菌病。白念珠菌的多種生態(tài)特征與它能夠利用多種糖類作為碳源密切相關(guān)[3]。己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是白念珠菌糖類利用途徑中重要的膜蛋白,對于白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)換和毒力侵襲至關(guān)重要[4]。本研究應(yīng)用抗真菌藥物特比萘酚對白念珠菌己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白雙等位基因缺失株Cahxt5進(jìn)行表型分析,研究該基因缺失后的表型效應(yīng),為指導(dǎo)臨床用藥和靶向新藥開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 野生型白念珠菌菌株SC5314,雙缺失株Cahxt5為石家莊學(xué)院化工學(xué)院實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存。

1.1.2 試劑 酵母提取物為北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司原裝Oxiod Ltd England產(chǎn)品,批號1116795-02;蛋白胨為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號20080408;瓊脂粉為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品,批號20010802;標(biāo)準(zhǔn)胎牛血清為天津市灝洋生物制品科技有限公司產(chǎn)品,批號TBD31HB;特比萘酚為山東齊魯制藥廠提供,為標(biāo)準(zhǔn)粉劑。二甲基亞砜為德國Merk公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 測試培養(yǎng)板和液體培養(yǎng)基的制備 按常規(guī)方法配制YPD液體培養(yǎng)基(20 g/L蛋白胨、20 g/L葡萄糖、10 g/L酵母提取物),固體YPD培養(yǎng)基中加入20 g/L的瓊脂粉。特比萘酚溶于二甲基亞砜溶液中,母液質(zhì)量濃度為1 mg/mL,工作液濃度分別為0、25、50、75、100 μ g/mL,分別加入YPD固體培養(yǎng)基中制成相應(yīng)濃度的特比萘酚平板培養(yǎng)基。

1.2.2 倍比稀釋試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)方法并加以改進(jìn)[5-6]。在1.5 mL無菌離心管中加入900 μ L無菌水,取對數(shù)生長后期細(xì)胞培養(yǎng)物100 μ L,加入混勻后,取100 μ L加入第2個含有900 μ L無菌水的離心管中,依次類推,分別將原液做成10—1、10—2、10—3、10—4、10—5和10—6系列濃度,分別取各稀釋液2 μ L點(diǎn)接特比萘酚平板,同時以YPD平板做對照。30℃倒置培養(yǎng)。

1.2.3 菌絲誘導(dǎo)形成和特比萘酚抑制試驗(yàn) 將野生型白念珠菌SC5314和CaHXT5缺失株過夜培養(yǎng)至平臺期,按照1∶10體積比轉(zhuǎn)接YPD液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對數(shù)生長期后,加入終濃度為100 mL/L的小牛血清,30℃分別誘導(dǎo)0、1、2、4 h后顯微鏡下觀察菌絲形成情況;按上述同樣方法,同時加入終濃度為75 μ g/mL的特比萘酚進(jìn)行鏡檢觀察。

1.2.4 試驗(yàn)圖像采集與處理 用Olympus E-3數(shù)碼相機(jī)采集圖像,Adobe photoshop CS軟件處理。

2 結(jié)果

2.1 特比萘酚對CaHXT5缺失株生長的影響

倍比稀釋試驗(yàn)前,由于初始細(xì)胞均處于平臺期飽和狀態(tài),故細(xì)胞密度相似。將白念珠菌野生型菌株SC5314和缺失株CaHXT5細(xì)胞在含有不同濃度的特比萘酚平板上進(jìn)行點(diǎn)接試驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn),與野生型相比,CaHXT5缺失株細(xì)胞在75 μ g/mL的特比萘酚平板上生長緩慢,特比萘酚濃度提到100 μ g/mL時更加明顯,相差2個稀釋度,表明CaHXT5基因缺失能夠增強(qiáng)細(xì)胞對特比萘酚的敏感性(圖1)。

圖1 CaHXT5缺失株在不同濃度特比萘酚平板上的表型分析Fig.1 Phenotype analysis of CaHXT 5 cell on plate with gradient concentration terbinafine

2.2 特比萘酚對CaHXT5基因缺失株菌絲形成的影響

白念珠菌菌絲形成是該菌致病的首要條件,CaHXT5基因缺失后影響白念珠菌的菌絲形成。為進(jìn)一步研究特比萘酚對白念珠菌缺失株CaHXT5細(xì)胞菌絲形成的影響情況,我們通過體外誘導(dǎo)菌絲形成試驗(yàn)來觀察特比萘酚存在下缺失株的致病性是否受到了影響。結(jié)果顯示在沒有特比萘酚存在下,CaHXT5細(xì)胞菌絲形成比野生型要慢得多;當(dāng)加入一定濃度的特比萘酚后,與野生型相比,CaHXT5菌株菌絲形成明顯受到抑制(圖2)。

圖2 100 mL/L小牛血清誘導(dǎo)下的特比萘酚影響CaHXT5缺失株的菌絲形成Fig.2 Induced filament formation of CaHXT5 strain by 100 mL/L calf serum under 75 μ g/mL terbinafine

3 討論

糖類利用途徑中的己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白是白念珠菌菌絲形成及致病力的重要因子。丙烯酰胺類藥物特比萘酚抑制麥角固醇合成中的角鱉烯環(huán)氧化酶催化活性,從而導(dǎo)致麥角固醇合成減少。為有效治療念珠菌感染,國內(nèi)外許多學(xué)者嘗試了特比萘酚和多種唑類藥物的聯(lián)合體外藥敏試驗(yàn)[7-11]。雖然這些措施能夠縮短療程,增加抗菌效果,但反復(fù)臨床應(yīng)用也能導(dǎo)致更多的耐藥菌株出現(xiàn)。通過糖類利用途徑來研究特比萘酚對真菌麥角固醇合成的影響還未見任何報(bào)道。

CaHXT5是白念珠菌中與毒力有關(guān)的葡萄糖高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[12-13],該基因?qū)?.24 mg/L的環(huán)比酮胺有較高抗性[14]。鑒于以上試驗(yàn)數(shù)據(jù),本試驗(yàn)采用簡單、重現(xiàn)性好的倍比稀釋方法來分析己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CaHXT5缺失的白念珠菌細(xì)胞對于特比萘酚的敏感表型。從本試驗(yàn)的表型分析結(jié)果來看,糖類利用途徑缺陷導(dǎo)致細(xì)胞糖類吸收出現(xiàn)障礙,使特比萘酚對角鱉烯環(huán)氧化酶的催化活性快速失活,這為通過己糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白為靶標(biāo)篩選新的抗真菌藥物或者依據(jù)特比萘酚母環(huán)來設(shè)計(jì)新型衍生物候選藥提供了極為有價值的理論參考。

[1] Moudgal V,Sobel J.Antifungals to treat Candida albicans[J].Ex pert Opin Pharmacother,2010,11(12):2037-2048.

[2] Labbé A C,Pépin J,Patino C,et al.Asingle-centre 10-year experience with Candida bloodstream infections[J].Can J Infect Dis Med Microbiol,2009,20(2):45-50.

[3] Fan J,Chaturvedi V,Shen S H.Identification and phylogenetic analysis of a glucose transporter gene family from the human pathogenic y east Candida albicans[J].J Mol Evol,2002,55(3):336-346.

[4] Buziol S,Warth L,Magario I,et al.Dynamic response of the expression of hxt1,hxt5 and hxt7 transport proteins in Saccharomyces cerevisiae to perturbations in the extracellular glucose concentration[J].J Biotechnol,2008,134(3-4):203-10.

[5] 孫彥偉,劉建營,徐維加,等.熒光定量RT-PCR檢測豬日本腦炎病毒[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2007,28(8):13-17.

[6] 王云龍,劉建營,韓 潔,等.豬瘟病毒熒光定量PCR檢測方法的建立[J].動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2009,30(5):36-40.

[7] 蘭建華,張 棟,張樹錫.特比萘酚聯(lián)合氟康唑?qū)δ钪榫靶律[球菌的體外藥敏試驗(yàn)[J].中國病原生物學(xué)雜志,2007,2(3):173-174.

[8] Antunes T A,Nobre M O,Faria R O,et al.Experimental cutaneous sporotrichosis:in vivo evaluation of itraconazole and terbinafine[J].Rev Soc Bras Med Trop,2009,42(6):706-710.

[9] Bueno J G,Martinez C,Zapata B,et al.In vitro activity of fluconazole,itraconazole,voriconazole and terbinafine against fungi causing onychomycosis[J].Clin Ex p Dermatol,2010,35(6):658-663.

[10] Odds F C.In Candida albicans,resistance to flucytosine and terbinafine is linked to MA T locus homozygosity and multilocus sequence typing clade 1[J].FEMS Yeast Res,2009,9(7):1091-101.

[11] Hynninen V V,Olkkola K T,Bertilsson L,et al.Effect of terbinafine and voriconazole on the pharmacokinetics of the antidepressant venlafaxine[J].Clin Pharmacol Ther,2008,83(2):342-348.

[12] Victoria B,Jessica A S.Johnston M.A glucose sensor in Candida albicans,eukaryotic cell[J].2006,26:1726-1737.

[13] Brown V,Sabina J,Johnston M.Specialized sugar sensing in diverse fungi[J].Curr Biol,2009,19(5):436-441.

[14] Robin E B,Teresa T,Barker K S.Genome-wide expression profiling of the response to ciclopirox olamine in Candida albicans[J].J Antimicrob Chemother,2005,55:655-662.