β-防御素在天然免疫中的作用*

孫 巖,王 路,溫俊歌,薄聯(lián)鋒,徐志坤,張德禮*

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院,陜西楊陵712100;2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,河北保定071000)

防御素(defensins)廣泛存在于生物界,具有廣譜抗微生物活性,屬于生物體天然免疫系統(tǒng),是古老防御機(jī)制的一部分。β-防御素是Diamond等1991首先在牛的氣管黏膜上皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的,后又在牛粒性白細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了13種與其高度相似的序列,但共有序列與α-防御素不同,故被命名為β-防御素,主要分布于牛的骨髓以及人和多種動(dòng)物(牛、羊、豬、駱駝、馴鹿、小鼠、大鼠)的胃腸道、呼吸道、舌、牙齦、腎、皮膚的上皮中。

1 防御素的種類(lèi)與β-防御素的結(jié)構(gòu)

防御素是一類(lèi)富含半胱氨酸和精氨酸的內(nèi)源性陽(yáng)離子低分子抗微生物短肽。根據(jù)防御素分子內(nèi)半胱氨酸和精氨酸的位置、連接方式、前體性質(zhì)及表達(dá)位置的差異可分為5種類(lèi)型,即α-防御素,β-防御素,θ-防御素,昆蟲(chóng)防御素,植物防御素。

成熟的β-防御素由38～42個(gè)氨基酸殘基組成,它的分子結(jié)構(gòu)中含有6個(gè)保守的半胱氨酸殘基,分子中二硫鍵連接方式為Cys1-Cys5、Cys2-Cys4、Cys3-Cys6。β-防御素由2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子組成,外顯子1編碼防御素前體分子的信號(hào)肽序列和部分前片段序列,外顯子2編碼部分前片段序列和成熟肽序列。

2 天然免疫系統(tǒng)

天然免疫系統(tǒng)是宿主抵抗多種病原微生物的第一道防線,在感染后迅速被激活,抑制病原的復(fù)制。天然免疫機(jī)制包括物理防線、體液免疫和細(xì)胞免疫等方面。物理防線是最外層的屏障,包括皮膚、內(nèi)皮層以及他們分泌的因子。一旦病原突破第一道防線,天然免疫細(xì)胞就會(huì)被激活繼而分泌細(xì)胞因子和趨化因子來(lái)抑制病原體的復(fù)制。先天免疫細(xì)胞激活的基礎(chǔ)即模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor,PRR)在很多免疫細(xì)胞中表達(dá),如巨噬細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞和B細(xì)胞。由于這些受體的存在,天然免疫細(xì)胞可以識(shí)別許多微生物共有的保守結(jié)構(gòu)。目前研究最多的模式識(shí)別受體是Toll樣受體(toll-like receptor,TLR)。

3 β-防御素的抗病原體活性

作為天然免疫的一部分,β-防御素可以保護(hù)宿主免受多種病原體的入侵,如細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲(chóng)等。

在抗菌方面,β-防御素有廣譜、高效的抗菌活性。一方面β-防御素能穿透菌體細(xì)胞壁和細(xì)胞膜,殺死一些耐抗生素的細(xì)菌[1],另一方面即使是合成的類(lèi)似人β-防御素(humen beta defensin,hBD1-3)碳末端結(jié)構(gòu)域的多肽同樣具有抗菌活性[2],經(jīng)其處理過(guò)的大腸埃希菌有明顯的形態(tài)學(xué)變化。然而β-防御素也有偏好性,如hBD2優(yōu)先殺死革蘭陰性菌綠膿桿菌,而非革蘭陽(yáng)性菌葡萄球菌。同時(shí)不同種類(lèi)的β-防御素抑菌機(jī)制也不同,hBDs可以黏附于結(jié)核分支桿菌的細(xì)胞膜,而hBD3還可以抑制葡萄球菌細(xì)胞壁的生成[3]。此外Scudiero O等[4]通過(guò)比較7種人工合成的hBD類(lèi)似物確定了β-防御素發(fā)揮抗菌活性的核心結(jié)構(gòu)域,如hBD1、hBD3的核心結(jié)構(gòu)域分別位于肽鏈中部和羧基端。

在抗真菌方面,研究表明防御素尤其是β-防御素在體外可以殺死或抑制真菌的繁殖,如hBD1[5]可以抑制多種念珠菌如白念珠菌、克柔假絲酵母菌、近平滑假絲酵母菌、光滑假絲酵母菌,而hBD2和hBD3雖有類(lèi)似的抑制真菌的效果,但對(duì)光滑假絲酵母菌不起作用。此外,防御素還可以阻止光滑假絲酵母黏附到上皮細(xì)胞從而抑制其感染。

在抗病毒方面,β-防御素可以抑制多種被膜病毒的感染。hBD2、hBD3抑制人類(lèi)免疫缺陷病毒(HIV-1)的復(fù)制;在傳染性軟疣病毒感染患處,hBD3的表達(dá)量大幅上升[6];豬源β-防御素(porcine beta defensin,pBD3)能顯著抑制豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)感染猴腎細(xì)胞Marc-145[7];hBD2在抗呼吸道合胞病毒(RSV)中發(fā)揮重要作用,主要機(jī)制為RSV激活NF-κ B信號(hào)通路,介導(dǎo)產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子-腫瘤壞死因子(TNF),從而調(diào)節(jié)hBD2的表達(dá)[8]。試驗(yàn)表明體外重組鼠β-防御素(murine beta defensin,mBD)可以阻止流感病毒入侵,從而抵抗病毒感染[9]。

在抗寄生蟲(chóng)方面,hBD1和hBD2可以在腸道內(nèi)有效抑制多種隱孢子蟲(chóng)孢子發(fā)芽,從而抑制體內(nèi)隱孢子蟲(chóng)孢子的感染。

β-防御素的抗菌活性依賴(lài)于離子種類(lèi)和濃度,如Vylkova S等[10]發(fā)現(xiàn)hBD2殺死白念珠菌依賴(lài)于鹽離子濃度。β-防御素對(duì)鹽離子敏感的程度不同,在hBD1-4中hBD3是最不敏感的。

4 β-防御素與炎癥反應(yīng)

炎癥反應(yīng)可以使組織消除有害刺激,啟動(dòng)組織愈合。但是不恰當(dāng)?shù)难装Y反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致組織損壞甚至疾病,所以當(dāng)機(jī)體不再需要炎癥反應(yīng)時(shí)應(yīng)當(dāng)立即終止。就這一點(diǎn)而言,β-防御素在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。終止的機(jī)制首先是β-防御素刺激產(chǎn)生內(nèi)源分子如抗炎癥細(xì)胞因子、脂質(zhì)介質(zhì)、糖皮質(zhì)激素,其次是誘導(dǎo)免疫細(xì)胞凋亡。

β-防御素可以誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子和趨化因子。研究表明hBD2-4能夠刺激角質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子和趨化因子如IL-6、IL-10、IFN-γ誘導(dǎo)蛋白(IFN-γinducible protein,IP-10)、單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemoattractant protein,MCP-1)等來(lái)激活T細(xì)胞表達(dá)和細(xì)胞因子分泌[11]。

還有研究表明hBDs能夠調(diào)節(jié)炎癥因子,對(duì)外周血中性粒細(xì)胞(peripheral blood neutrphils,PMN)的凋亡產(chǎn)生影響,Nagaoka I等[12]證明hBDs能夠抑制PMN的凋亡,延長(zhǎng)細(xì)胞周期從而防御病原菌入侵,其主要機(jī)制為hBDs尤其是hBD3可以激活人趨化因子受體(chemokine(C-C motif)receptor 6,CCR6),從而下調(diào)促凋亡蛋白truncated Bid的表達(dá),上調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL的表達(dá),同時(shí)抑制線粒體膜半胱氨酸蛋白酶(caspase-3)的活性。另外,hBD2可以促進(jìn)臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞管道形成,調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)時(shí)的血管生成。

5 β-防御素與趨化作用

β-防御素除了具有直接的抗病原微生物活性以外,還可以在天然免疫中發(fā)揮趨化作用。不同的防御素在特定濃度時(shí)可以選擇性趨化天然免疫系統(tǒng)中的白細(xì)胞,通過(guò)吞噬方式來(lái)抵御和消滅入侵的病原微生物,hBD1趨化單核細(xì)胞,hBD2趨化肥大細(xì)胞,hBD3-4趨化巨噬細(xì)胞[13]。另外hBD2功能[14]類(lèi)似于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子,達(dá)到一定劑量后,促進(jìn)傷口愈合以及內(nèi)皮毛細(xì)血管的形成。

此外,防御素可以趨化非成熟的樹(shù)突狀細(xì)胞(immature dendritic cells,iDCs),在感染部位獲取和遞呈病原微生物抗原,啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答。其中,β-防御素趨化作用是最強(qiáng)的,試驗(yàn)證明,hBD2、hBD3以及mBDs可以和CCR2相互作用介導(dǎo)趨化作用,Rohrl J等[15]體外試驗(yàn)表明,mBD4和hBD2對(duì)表達(dá)CCR6的小鼠細(xì)胞均有趨化作用。還有試驗(yàn)表明mBD2即使在LPS結(jié)合蛋白不存在的情況下,也可以通過(guò)上調(diào)共刺激分子CD40、CD80、CD86、MHCII、CCR7,直接作用于iDCs促進(jìn)DC的成熟[16],mBD2介導(dǎo)的成熟DCs可以促進(jìn)Th1的極化以及促炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。

二硫鍵連鍵模式對(duì)β-防御素的趨化功能有重要意義[17]。真核表達(dá)hBD3活性研究表明,當(dāng)所有半胱氨酸殘基被替代以后,二硫鍵消失,hBD3趨化活性喪失。防御素的趨化作用具體機(jī)制尚不明確,目前主要有三種假設(shè):替換配體模型、膜破裂模型、反式激活模型[18]。

6 β-防御素與Toll樣受體

大量證據(jù)表明,防御素和T LRs有密切的聯(lián)系,尤其是β-防御素和細(xì)胞外T LRs[19]。例如鼠的β-防御素2(murine beta defensin 2,mBD2)通過(guò)T LR4激活NF-κ B信號(hào)通路[20]。在轉(zhuǎn)染TLR4和鼠髓樣分化蛋白-2(myeloid differentiation protein-2,MD2)的人胚胎腎細(xì)胞(human embryonic kidney,HEK)293中,mBD2可以激活NF-κ B,而不轉(zhuǎn)染的NF-κ B則不能被激活。具體機(jī)制為mBD2是T LR4的內(nèi)源性配體,可以介導(dǎo)樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)的成熟。而人工合成的hBD3既可以激活DC又可以殺死DC。還有報(bào)道顯示hBD3通過(guò)MyD88/IRAK/NF-κ B信號(hào)通路與T LR1和TLR2相互作用,激活專(zhuān)職抗原遞呈細(xì)胞[21]。由此可見(jiàn),β-防御素通過(guò)與受體相互作用,能夠很好調(diào)節(jié)抗原遞呈細(xì)胞的功能狀態(tài),從而發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用。

另外,活化的T LRs可以促進(jìn)β-防御素產(chǎn)生并調(diào)節(jié)其活性。人膽管上皮的T LR2和TLR4的激活,不同程度的促進(jìn)hBDs的產(chǎn)生,從而提高宿主抗隱孢子蟲(chóng)感染的能力。角膜上皮細(xì)胞經(jīng)綠膿桿菌感染后,用低劑量鞭毛蛋白(T LR5激動(dòng)劑)處理,結(jié)果不僅使hBD2的mRNA的表達(dá)量增加,TNF-α和IL-8分泌也增多[22]。同時(shí)Sumikawa Y等[23]通過(guò)鼠試驗(yàn)表明,脂多肽可以通過(guò)T LR2/MyD88依賴(lài)的信號(hào)通路,刺激角質(zhì)形成細(xì)胞中mBD3的表達(dá),提高TNF-α和IL-1α的分泌。

7 結(jié)語(yǔ)

細(xì)菌對(duì)抗生素的耐藥性是當(dāng)今臨床醫(yī)學(xué)中的全球性難題,開(kāi)發(fā)新的抗感染藥物勢(shì)在必行。而β-防御素具有高效、廣譜的抗菌作用,且不會(huì)產(chǎn)生耐藥性和毒副作用,有很大的藥用價(jià)值,同時(shí)對(duì)免疫細(xì)胞有趨化功能,參與免疫調(diào)節(jié),可以作為佐劑調(diào)節(jié)機(jī)體免疫系統(tǒng)。雖然目前對(duì)于防御素的應(yīng)用還有許多問(wèn)題亟待解決,但是隨著科技的不斷進(jìn)步,β-防御素的研究將不斷深入,有助于闡明某些疾病的發(fā)病機(jī)制,并為開(kāi)發(fā)新型抗菌藥物提供理想的分子骨架和模板,給治療一些頑固的感染性疾病帶來(lái)新的希望。

[1] Verma C,Seebah S,Low S M,et al.Defensins:antimicrobial peptides for therapeutic development[J].Biotechnol J,2007,2(11):1353-1359.

[2] Krishnakumari V,Nagaraj R.Interaction of antibacterial peptides spanning the carboxy-terminal region of human b-defensins 1-3 with phospholipids at the ai-water interface and inner membrane ofE.coli[J].PEPT IDE,2008,29:7-14.

[3] Sass V,Schneider T,Wilmes M,et al.Human beta-defensin 3 inhibits cell wall biosynthesis in staphylococci[J].Infect Immun,2010,78(6):2793-2800.

[4] Scudiero O,Galdiero S,Cantisani M,et al.Novel synthetic,salt-resistant analogs of human beta-defensins 1 and 3 endowed with enhanced antimicrobial activity[J].Antimicrob Agents Chemother,2010,54(6):2312-2322.

[5] Feng Z,Jiang B,Chandra J,et al.Human beta-defensins:differential activity against Candidal species and regulation by Candida albicans[J].J Dent Res,2005,84:445-450.

[6] Sang Y,Ruchala P,Lehrer R I,et al.Antimicrobial host defense peptides in an arteriviral infection:differential peptide expression and virus inactivation[J].Viral Immunol,2009,22(4):235-242.

[7] Kota S,Sabbah A,Chang T H,et al.Role of human β-defensin-2 during tumor necrosis factor-α/NF-κ B-mediated Innate antiviral response against human respiratory syncytial virus[J].J Biol Chem,2008,283(33):22417-22429.

[8] Meyer-Hoffert U,Schwarz T,Schroder J M,et al.Increased expression of human beta-defensin 3 in mollusca contagiosum[J].Clin Exp Dermatol,2010,35(2):190-192.

[9] Gong T,Jiang Y,Wang Y,et al.Recombinant mouse betadefensin 2 inhibits infection by influenza A virus by blocking its entry[J].A rch Virol,2010,155(4):491-498.

[10] Vylkova S,Nayyar N,Li W,et al.Human beta-defensins kill Candida albicans in an energy-dependent and salt-sensitive manner without causing membrane disruption[J].Antimicrob Agents Chemother,2007,51(1):154-161.

[11] Niy onsaba F,Ushio H,Nakano N,et al.Antimicrobial peptides human beta-defensins stimulate epidermal keratinocyte migration,proliferation and production of proinflammatory cytokines and chemokines[J].J Invest Dermatol,2007,127(3):594-604.

[12] Nagaoka I,Niyonsaba F,Tsutsumi-Ishii Y,et al.Evaluation of the effect of human beta-defensins on neutrophil apoptosis[J].Int Immunol,2008,20(4):543-553.

[13] McDermott A M.Defensins and other antimicrobial peptides at the ocular surface[J].Ocul Surf,2004,2:229-247.

[14] Baroni A,Donnarumma G,Paoletti I,et al.Antimicrobial human beta-defensin-2 stimulates mig ration,proliferation and tube formation of human umbilical vein endothelial cells[J].Peptides,2009,30(2):267-272.

[15] Rohrl J,Yand D,Oppenheim J J,et al.Human β-defensin 2 and 3 and their mouse orthologs induce chemotaxis through interaction with CCR2[J].J Immunol,2010,184:6688-6694.

[16] Biragyn A,Coscia M,Nagashima K,et al.Murine beta-defensin 2 promotes TLR-4/MyD88-mediated and NF-kappaB-dependent a typical death of APCs via activation of TNFR2[J].J Leukoc Biol,2008,83(4):998-1008.

[17] 李詠蘭,邱廣亮.β-防御素的合成及構(gòu)效關(guān)系[J].內(nèi)蒙古師范大學(xué)學(xué)報(bào),2010,39(4):421-424.

[18] Lai Y,Gallo R L.AM Ped up immunity:how antimicrobial peptides have multiple roles in immune defense[J].T rends Immunol,2009,30(3):131-141.

[19] Hazlett L,Wu M.Defenses in innate immunity[J].Cell Tissue Res,2010,343(1):175-188.

[20] Hornef M W,Frisan T,Vandewalle A,et al.Toll-like receptor 4 resides in the Golgi apparatus and colocalizes with internalized lipopoly saccharide in intestinal epithelial cells[J].J Exp Med,2002,195:559-570.

[21] Funderburg N,Lederman M M,Feng Z,et al.Human-defensin-3 activates professional antigen-presentingcells via Toll-like receptors 1 and 2[J].Proc Natl Acad Sci,2007,104(47):18631-18635.

[22] Kumar A,Yin J,Zhang J,et al.Modulation of corneal epithelial innate immune response to pseudomonas infection by flagellin pretreatment[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2007,48(10):4664-4670.

[23] Sumikawa Y,Asada H,Hoshino K,et al.Induction of betadefensin 3 in keratinocy tes stimulated by bacterial lipopeptides through toll-like receptor 2[J].Microbes Infect,2006,8(6):1513-1521.