胞質(zhì)HuR在卵巢上皮性癌的表達(dá)及意義

齊玉明 石彬 郭皓 成艷梅

胞質(zhì)HuR在卵巢上皮性癌的表達(dá)及意義

齊玉明 石彬 郭皓 成艷梅

目的檢測HuR在卵巢上皮性癌中的表達(dá)及與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，尋求卵巢癌的預(yù)后因素。方法 采用免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法和逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR技術(shù)，檢測胞質(zhì)和胞核HuR在正常、交界性、惡性卵巢組織中的表達(dá);分析胞質(zhì)HuR的表達(dá)與預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果 胞質(zhì)和胞核HuR在惡性卵巢腫瘤組織的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織，胞質(zhì)和胞核HuR在交界性卵巢腫瘤的表達(dá)與正常卵巢組織比較無顯著性差異;胞質(zhì)HuR的表達(dá)隨組織學(xué)分級、臨床分期增高，陽性表達(dá)率逐漸增高，胞核HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)無關(guān)。結(jié)論 HuR的過表達(dá)可能在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，檢測胞質(zhì)HuR在卵巢癌中的表達(dá)可預(yù)測該腫瘤生物學(xué)行為特征，可作為獨(dú)立的預(yù)后指標(biāo)。

卵巢上皮性癌;胞質(zhì);胚胎致死異常視覺A;預(yù)后

HuR是RNA結(jié)合蛋白中胚胎致死異常視覺(ELAV)家族的一員，ELAV家族是最緊密的RNA結(jié)合蛋白。HuR廣泛存在于幾乎所有的增殖細(xì)胞中，通過一定的信號途徑參與細(xì)胞的增殖、分化等多種細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)。人體內(nèi)有多種細(xì)胞可分泌HuR，但在一些正常組織中表達(dá)水平很低，而在許多惡性腫瘤中表達(dá)水平增高，且與預(yù)后不良有關(guān)。本研究旨在檢測HuR在卵巢上皮性癌的表達(dá)，并分析胞質(zhì)HuR表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系，為臨床治療提供新的途徑。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2001年6月至2008年8月，在河北醫(yī)科大學(xué)第二臨床學(xué)院婦科因卵巢上皮性癌而接受手術(shù)治療的患者68例，平均年齡52歲。術(shù)前均未接受放療、化療、激素及免疫治療，術(shù)后病理組織學(xué)診斷明確。按照WHO(1973)標(biāo)準(zhǔn)將研究對象進(jìn)行組織學(xué)分類及分級，其中包括漿液性囊腺癌44例，黏液性囊腺癌18例，子宮內(nèi)膜癌6例;病理分級:高分化10例，中分化30例，低分化28例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者30例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者38例;按照2000年FIGO臨床分期標(biāo)準(zhǔn)，其中Ⅰ期11例，Ⅱ期16例，Ⅲ期31例，Ⅳ期10例;選擇同期交界性卵巢腫瘤10例(漿液性6例和黏液性4例)和同期因其他原因行子宮+雙附件切除的正常卵巢5例。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集:腫瘤切下后，從腫瘤生長活躍、無壞死的邊緣部位取下約1 cm3大小的組織2塊，一塊放入甲醛溶液固定、石蠟包埋，用于免疫組化測定;另一塊裝入酶滅活的凍存管，迅速投入液氮中，然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱保存待測。

1.2.2 免疫組化法檢測卵巢上皮性癌組織、交界性卵巢腫瘤組織、正常卵巢組織中HuR的表達(dá):標(biāo)本常規(guī)脫水、包埋并制成4 μm厚的連續(xù)切片，采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接(SP)法，進(jìn)行組化檢測。兔抗人多克隆HuR抗體為Santa Cruz產(chǎn)品，兔SP免疫組化試劑盒、DAB試劑盒均購于北京中杉金橋試劑公司。染色步驟按SP試劑盒(北京中杉金橋試劑公司)說明書進(jìn)行，一抗滴度為1∶200。磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗做陰性對照。

1.2.3 RT-PCR技術(shù)檢測卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中HuR mRNA的表達(dá):引物及試劑盒由北京賽百盛基因有限公司提供。采用 TRIzol一步法提取組織總 RNA。反應(yīng)總體積20 μl，RNA 模板量1 μg，參照試劑盒說明進(jìn)行。產(chǎn)物長度及引物序列如下:HuR片段長度為 220 bp，上游引物:5’CGCAGAGATTCAGGTTCTCC-3’，下游:5’CCAAACCCTTTGCACTTGTT-3’;β-actin 片段長度為 540 bp，上游引物:5’GTGGGGCGCCCCAGGCACCA-3’，下游引物:5’CTCCTTAATGTCACGCACGATTTC-3’。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3 min、94℃變性 40 s、58℃退火 40 s、72℃延伸 40 s，33 次循環(huán)后 72℃延伸5 min。取5μl PCR產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，β-actin作為內(nèi)參照物，紫外透射成像系統(tǒng)顯像，測定特異條帶的密度并與內(nèi)參照比較，得出目的基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件，計數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，計量資料以±s表示，采用t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胞核HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢中的表達(dá) 胞核HuR在卵巢癌、交界性腫瘤及正常卵巢中的陽性表達(dá)率分別為76.47%(52/68)、30.00%和0。卵巢癌中胞核HuR的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢(P＜0.05)。見表 1，圖1。

表1 HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織胞核中的表達(dá) 例(%)

圖1 胞核HuR在子宮內(nèi)膜樣卵巢癌的陽性表達(dá)(SP×400)

2.2 胞質(zhì)HuR在卵巢癌、交界性腫瘤和正常卵巢中的表達(dá)胞質(zhì)HuR在卵巢癌、交界性腫瘤及正常卵巢中的陽性表達(dá)率分別為45.60%(31/68)、10.00%和0。卵巢癌中胞質(zhì)HuR的表達(dá)明顯高于交界性卵巢腫瘤和正常卵巢(P＜0.05)。見表2，圖 2。)

表2 胞質(zhì)HuR在卵巢上皮性癌、交界性卵巢腫瘤和正常卵巢組織中的表達(dá) 例(%)

圖2 胞質(zhì)HuR在漿液性卵巢癌的陽性表達(dá)(SP×400

2.3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達(dá) 68例卵巢癌中54例為陽性表達(dá)(79.41%)，5例正常卵巢中1例為陽性表達(dá)(20.00%)，卵巢上皮性癌和正常卵巢組織中HuR mRNA表達(dá)水平分別為0.381±0.034和0.114，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.01)。見表3，圖3。

表3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達(dá)±s

表3 正常卵巢與卵巢上皮性癌組織HuRmRNA的表達(dá)±s

類別 HuRmRNA光密度值 P值正常卵巢組織(n=5)0.112±0.011 ＜0.01卵巢癌(n=68)0.381±0.034

圖3 正常卵巢與卵巢上性癌組織HuRmRNA的表達(dá)

2.4 胞質(zhì)HuR的表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系 胞質(zhì)HuR與卵巢癌臨床分期和組織學(xué)分級有相關(guān)性，而與發(fā)病年齡、組織學(xué)類型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。臨床分期Ⅲ～Ⅳ期胞質(zhì)HuR的陽性表達(dá)率(56.09%)顯著高于Ⅰ～Ⅱ期(29.63%)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。在組織學(xué)分級1級(高分化)、2級(中分化)、3級(低分化)胞質(zhì)HuR的陽性表達(dá)率分別為10.00%、46.67%、57.14%，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，胞質(zhì)HuR的表達(dá)在中、低分化之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 胞質(zhì)HuR的表達(dá)與卵巢上皮性癌臨床病理學(xué)特征的關(guān)系

3 討論

3.1 HuR在卵巢上皮性癌中表達(dá)的意義 HuR是ELAV家庭的一員，又稱為類胚胎致死異常視覺蛋白A。ELAV家庭是最緊密的RNA結(jié)合蛋白，最初是在果蠅中被發(fā)現(xiàn)。ELAV家庭共包括四個成員:HuD、HuC、Hel-N1(HuB)和 HuR。HuR幾乎在所有增殖的細(xì)胞中表達(dá)，而其他三個成員主要表達(dá)在終端分化的神經(jīng)組織中。1996年，Ma等［1］利用PCR技術(shù)首先識別并克隆了HuR基因。許多早期反應(yīng)基因的mRNAs在其3'非翻譯區(qū)(untranslated regins，UTR)有 AU富含元件(AU-rich elements，AREs)，可以與順式反應(yīng)元件一起調(diào)節(jié)mRNAs的不穩(wěn)定性。HuR分子量為36 kD，HuR即可與AREs相互作用，并且在轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞后穩(wěn)定包含AREs的mRNAs并使之過表達(dá)，導(dǎo)致HuR表達(dá)增強(qiáng)。在人類許多惡性腫瘤，如乳腺癌［2］、結(jié)腸癌［3］、胃癌［4］、肺癌等中HuR的陽性表達(dá)率明顯增高，表明HuR在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中有一定作用［5］。本實(shí)驗(yàn)顯示，HuR在卵巢上皮性癌中的表達(dá)明顯高于交界性腫瘤和正常卵巢。為進(jìn)一步證實(shí)HuR在惡性腫瘤中的表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)又從mRNA水平檢測HuR的表達(dá)率。結(jié)果顯示:HuRmRNA在卵巢癌的表達(dá)率顯著高于正常卵巢。表明，HuR的異常表達(dá)與卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系。HuR作為一種RNA結(jié)合蛋白，一方面可與許多基因的mRNA結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、分化、血管發(fā)生、蛋白表達(dá)調(diào)控等，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。另一方面，HuR還可與許多基因相結(jié)合，如環(huán)氧合酶 2［6］、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)［7］、炎性因子 IL-8、6 和腫瘤壞死因子(TNF)［8］、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白 cyclinA和 cyclinB1、蛋白激酶 C的底物MARCKS，原癌基因 c-fos，uPA 和 uPA 受體等［9］，這類基因與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和浸潤密切相關(guān)。推測，HuR的表達(dá)上調(diào)可能是這些基因表達(dá)上調(diào)的原因之一，從而引起惡性腫瘤的發(fā)生。

3.2 HuR在胞質(zhì)和胞核的表達(dá)及與臨床指標(biāo)的關(guān)系 近來研究表明HuR可以在核質(zhì)間穿梭［10］，HuR即可在胞核表達(dá)，也可在胞質(zhì)表達(dá)。Hu蛋白含有3個保守的RNA識別模序(RNA recognition motifs，RRMs)，在RRM2和RRM3之間有鉸鏈區(qū)，該區(qū)內(nèi)含一段包含52個氨基酸的HuR核質(zhì)穿梭(HuR nucleocytoplasmic shuttling，HNS)區(qū)，對細(xì)胞定位和功能相當(dāng)重要?？上扰c包含ARE的mRNAs在細(xì)胞核內(nèi)結(jié)合，然后與之一起進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，保護(hù)mRNAs避免其衰變降解，從而導(dǎo)致HuR在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)。Gallouzi等［11］研究表明HuR可以通過2種不同途徑進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)。一種是需要4種蛋白配體的依賴染色體區(qū)域維持蛋白質(zhì)(CRM1)，另一種是非依賴CRM1而需要HNS，正是通過上述兩種機(jī)制，使HuR在核與質(zhì)間穿梭，從而使HuR在胞核與胞質(zhì)均有表達(dá)。但是，許多結(jié)果顯示胞質(zhì)HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后有關(guān)，而胞核HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)和預(yù)后無關(guān)［12］。本研究選擇了與卵巢癌關(guān)系最密切的五個臨床參數(shù)，結(jié)果顯示，胞質(zhì)HuR在卵巢癌中的表達(dá)，隨著組織學(xué)分級的增加與分期的增加，表達(dá)率明顯增加。未發(fā)現(xiàn)胞核HuR的表達(dá)與臨床病理參數(shù)存在相關(guān)性。提示惡性程度越高，臨床分期越晚，卵巢癌組織中胞質(zhì)HuR的表達(dá)越強(qiáng)，患者的預(yù)后越差。胞質(zhì)HuR的表達(dá)可能是影響癌癥患者預(yù)后的因素之一［13］。但是對于其胞質(zhì)分布的機(jī)理，有待進(jìn)一步的研究。

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The expression and significance of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma

QI Yuming*，SHI Bin，GUO Hao，et al．The Second Department of Gynecology，Handan Central Hospital，Hebei，Handan 056000，China

ObjectiveTo investigate the correlation between the expression of HuR in epithelial ovarian cancer and clinicopathological parameters in order to explore the factors that affect the prognosis of patients with epithelial ovarian carcinoma.MethodsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in normal ovary tissues，borderline tissue of ovary tumor and epithelial ovarian carcinoma were detected by SP immunohistochemical technique and RT-PCR.The relationship between cytoplasmic HuR expression and prognostic factors was analyzed.ResultsThe expressions of cytoplasmic and nuclear HuR in epithelial ovarian cancer tissue were significantly higher than those in borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissues，however，there was no significant difference between the borderline tissue of epithelial ovarian tumor and normal ovarian tissue(P＞0.05).The statistical analysis showed that the positive expression rate of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma was closely correlated with histological grade and FIGO stage，but the positive expression rate of nuclear HuR was not correlated with the clinicopathological parameters.ConclusionThe over-expression of HuR may play an important role in the growth and progress of epithelial ovarian carcinoma.To detect the expression of cytoplasmic HuR in epithelial ovarian carcinoma may predict the characteristics of oncobiology behaviour.The expression of cytoplasmic HuR may act as an independent prognostic indicator.

epithelial ovarian carcinoma;cytoplasmic;HuR;prognosis

R 737.31

A

1002-7386(2011)09-1296-04

10．3969/j．issn．1002-7386．2011．09．005

056000 河北省邯鄲市中心醫(yī)院婦二科(齊玉明);河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科(石彬);河北省邯鄲市中心醫(yī)院ICU(郭皓)，婦二科(成艷梅)

石彬，050051 河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院婦科;E-mail:cysboy@sina.com

2010-10-11)

·論著·