金黃色葡萄球菌 isdB基因克隆、表達及其抗原性鑒定

崔 莉,朱戰(zhàn)波,朱洪偉,崔玉東,樸范澤

(1黑龍江八一農(nóng)墾大學動物科技學院,黑龍江大慶,163319;2廣東溫氏食品集團有限公司江蘇分公司;3黑龍江八一農(nóng)墾大學生命科技學院)

金黃色葡萄球菌是奶牛乳房炎的重要致病菌之一,也是人類醫(yī)源感染的常見病原菌,多為耐甲氧西林金黃色葡萄球菌。傳統(tǒng)的抗生素療法引起了金黃色葡萄球菌對多種抗生素的拮抗[1],已不能有效治療由金黃色葡萄球菌引起的感染,尤其發(fā)現(xiàn)有些分離株甚至對新型的抗生素也產(chǎn)生了耐藥性[2],所以人們把研究的重點轉(zhuǎn)向疫苗方面。隨著分子生物學的發(fā)展,基因工程疫苗的研究展示出良好的發(fā)展前景。國外一些學者對篩選疫苗靶向的方法進行了深入的研究,Yukiko等[3]用反向遺傳學方法在 8株金黃色葡萄球菌的染色體組序列中檢測出 19種保守性表面蛋白,同時鑒定出 4種產(chǎn)生高度保護性免疫的蛋白:IsdA,IsdB,SdrD和 SdrE。用這 4種表面蛋白免疫小鼠,與其它 15種抗原相比,產(chǎn)生了最高的保護水平,這項鑒定在篩選疫苗候選抗原的研究中具有重要意義。

金黃色葡萄球菌生長需要鐵作為營養(yǎng)物質(zhì),感染時它可以與宿主血紅素相互作用而攝取鐵。金黃色葡萄球菌鐵調(diào)控表面決定子(Isd)是與鐵吸收相關(guān)的一個重要成分[4],該系統(tǒng)能結(jié)合機體的血紅蛋白,并使血紅蛋白通過細胞壁和細胞膜,在細胞質(zhì)內(nèi)蓄積,一旦進入細胞,血紅素的咔啉環(huán)會被酶降解掉,形成能被細菌用作營養(yǎng)來源的自由鐵[5]。在 Isd基因座中,IsdB是唯一的完全暴露在細胞壁表面的蛋白,對金黃色葡萄球菌鐵的攝取具有重要作用。試驗證明,金黃色葡萄球菌是通過 IsdB捕獲血紅蛋白,在 IsdB失活、而IsdA和IsdH沒有失活的突變株中,細菌細胞壁結(jié)合到的血紅蛋白就會減少,同時也就削弱了金黃色葡萄球菌利用血紅蛋白作為鐵來源的能力[6]。Kuklin等[7]根據(jù) IsdB在不同的金黃色葡萄球菌臨床株中均具有保守性這一特點,將該蛋白制成疫苗免疫小鼠,結(jié)果獲得了高度的免疫,且在獼猴中也呈現(xiàn)出抗體效價的高水平增長。因此,利用 IsdB的鐵結(jié)合機制來發(fā)展抗金黃色葡萄球菌疫苗具有廣闊的前景。筆者通過對編碼金黃色葡萄球菌 IsdB蛋白的基因進行克隆,構(gòu)建原核表達載體,并在大腸桿菌中進行表達,旨在為進一步研究其在奶牛乳房炎免疫預防中的作用及新型 DNA疫苗奠定分子理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及載體 奶牛乳房炎致病菌金黃色葡萄球菌 BMSA/855/23-1株,表達載體 pQE-30和受體菌 E.coli XL1-Blue均為本實驗室保存;pMD18-T Vector System購自大連寶生物工程有限公司。

1.1.2 酶和試劑 LA Taq DNA聚合酶及核酸分子質(zhì)量標準購自大連寶生物工程有限公司,限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶以及低分子量蛋白質(zhì)標準均購自加拿大 MBI公司;DNA片段快速膠回收試劑盒購自北京博大泰克生物基因技術(shù)有限責任公司;鼠金黃色葡萄球菌多克隆抗體由本實驗室保存;辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG抗體購自 NEB公司;其它試劑為 Sigma公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物 根據(jù) GenBank中(登錄號:BA000033)金黃色葡萄球菌的 isdB基因序列設計一對 PCR擴增特異性引物,在上游引物的 5′端加上一個 Bam HI酶切位點(見下劃線)和 3個保護性堿基 CGG,下游引物的 5′端加上一個 Sal I酶切位點和 2個保護性堿基 GC,即上游引物為 5′-CGGGGATCCATGAACAAACAGCAAAAAGA-3′,下游引物為 5′-GCGTCGACTTAGTTTTTACGTTTTCTAG-3′。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 金黃色葡萄球菌 DNA的提取 將金黃色葡萄球菌用液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)后,離心,沉淀用葡萄球菌溶菌酶和蛋白酶 K處理,然后用酚、氯仿抽提提取金黃色葡萄球菌 DNA,方法詳見文獻[8]。

1.2.2 PCR擴增、克隆及序列分析 用 LA Taq DNA聚合酶進行 PCR擴增,反應條件:95℃預變性 3 min后,94℃變性 1.5min,60℃退火 1min,72℃延伸 2 min,進行 30個循環(huán),最后 72℃延伸 10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,用DNA膠回收試劑盒回收目的片段。16℃過夜連接pMD18-T載體,次日轉(zhuǎn)化到 XL1-Blue感受態(tài)細胞并涂布于含有終質(zhì)量濃度 50 mg/L氨芐青霉素的 LB瓊脂平板上,置 37℃培養(yǎng)。隨機挑選幾個菌落,用堿裂解法粗提質(zhì)粒,并對其進行 PCR和 Bam HI,Sal I雙酶切鑒定,篩選出的陽性菌送至上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司進行序列測定,預計 IsdB片段大小約為1 938 bp,pMD18-T載體大小約為 2 692 bp,測序后對測序結(jié)果用 DNAStar軟件進行序列分析。

1.2.3 重組蛋白原核表達載體的構(gòu)建 上述陽性質(zhì)粒命名為 pMD18-T-isdB,將該克隆質(zhì)粒和 pQE-30表達載體質(zhì)粒分別用Bam HI和 Sal I雙酶切,pQE-30表達載體片段大小約為 3 439 bp,回收目的基因片段和線狀表達載體。用 T4連接酶在 22℃條件下對目的基因片段和線狀表達載體進行過夜連接,按 1.2.2的方法轉(zhuǎn)化和鑒定陽性克隆,并將陽性菌命名為 pQE-30-isdB。

1.2.4 重組蛋白的誘導表達 將重組菌 pQE-30-isdB及空載體 pQE-30在含有 50mg/L氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)到 A600值達到 0.6時,加入 IPTG至終濃度為 1mmol/L,進行目的蛋白的誘導表達。分別取誘導前和誘導后 3 h的重組菌,誘導后 3 h的空載體 1mL菌液,4℃離心收集菌體。沉淀菌體中加入 1×SDS上樣緩沖液 100μL,混勻后,沸水加熱 5min,10 000 g離心 10min后,取上清 10μL,按參考文獻[8]的方法進行 SDS-PAGE分析。

1.2.5 estern blot分析 按照參考文獻[8]的方法以 BIO-RAD系統(tǒng)電轉(zhuǎn)移至 PVDF轉(zhuǎn)移膜上,用脫脂乳封閉后,依次加入鼠金黃色葡萄球菌多克隆抗體,辣根過氧化物酶標記羊抗鼠 IgG抗體,最后在聯(lián)苯胺(DAB)溶液中顯色,觀察結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 isdB基因擴增、TA克隆及其序列分析

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,結(jié)果顯示,獲得了全長約為 1 938 bp的條帶,與預期擴增產(chǎn)物大小一致(圖 1)。對pMD18-T-isdB質(zhì)粒進行PCR鑒定,結(jié)果擴增出與預計目的片段大小1 938 bp相符的條帶,將 PCR鑒定為陽性的質(zhì)粒用 Bam HI和 Sal I雙酶切鑒定,酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后,獲得預期大小的 2個目的基因片段(2 692 bp和 1 938 bp)(圖 2)。測序后,NCBIBlast分析顯示,該 DNA片段大小為 1 938 bp,與 GenBank中金黃色葡萄球菌株 MW 2的 isdB堿基序列的同源性為 98.6%。

2.2 重組蛋白原核表達載體的鑒定

對 pQE-30-isdB質(zhì)粒進行 PCR鑒定,經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,PCR鑒定結(jié)果為陽性,將該質(zhì)粒用Bam HI和 Sal I雙酶切得到 2個預期大小的片段(3 439 bp和 1 938 bp)(圖 3)。

3 討 論

金黃色葡萄球菌通過 IsdB蛋白介導鐵從宿主血紅蛋白轉(zhuǎn)移到細菌內(nèi),表現(xiàn)了 IsdB蛋白的一個重要的毒力作用。缺乏這種蛋白,金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的毒力卻會減少,該細菌在宿主組織中將無法正常復制和永久定居。有研究表明[6],當 IsdB與 AAHS(amorphous aluminum hydroxyphosphate sulfate)佐劑結(jié)合作為疫苗時,具有高度的免疫原性,產(chǎn)生的特異性抗體對鼠模型中不同分離株的金黃色葡萄球菌感染具有穩(wěn)定及顯著的保護作用。因此,IsdB是一個良好的疫苗侯選抗原。

本次研究應用基因工程方法成功地克隆了金黃色葡萄球菌包含了信號肽序列的全長 isdB基因,與報道的 isdB全長基因序列比較,其核苷酸和氨基酸序列同源性都為 98.6%,同源性很高,存在的少量差異基因可能是菌株的特異性所致。由于大腸桿菌是當前應用較廣泛的原核表達體系,具有培養(yǎng)方法簡單、快速、經(jīng)濟等優(yōu)點,所以在本次研究中選擇大腸桿菌來表達isdB基因。pQE-30載體能夠編碼 6個組氨酸殘基,外源基因經(jīng)多克隆位點插入后,可與 IsdB一起融合表達,這樣有利于提高表達產(chǎn)物的穩(wěn)定性,且融合蛋白經(jīng) Western blot試驗,發(fā)現(xiàn)能和金黃色葡萄球菌的陽性血清發(fā)生反應,說明該目的蛋白具有金黃色葡萄球菌的抗原性,可作為亞單位疫苗的候選蛋白。

近年來,在奶牛乳房炎疫苗研究過程中,金黃色葡萄球菌基因工程疫苗已成為了國內(nèi)外研究的熱點,如金黃色葡萄球菌的凝集因子 A,纖連蛋白結(jié)合蛋白,膠原結(jié)合蛋白,溶血毒素及腸毒素等均已被用作免疫抗原。isdB基因的克隆和 IsdB蛋白的成功獲得為今后進一步研究 IsdB亞單位疫苗的免疫效力及金黃色葡萄球菌致病機制提供了有力的工具和研究基礎,高度保守且免疫原性較強的 IsdB蛋白抗原可能作為基因工程疫苗的良好靶向,對臨床防治由金黃色葡萄球菌引起的感染將具有重要的意義。

[1] NICKERSON S C,OWEN W E,BODDIE R L.Mastitis in dairy Helfers:initial studies on prevalence and control[J].J Dairy Sci,1995,78(7):1 607-1 618.

[2] ANDEREGG,T R,SADER H S,FRITSCHE TR,et al.Trends in linezolid susceptibility patterns:report from the 2002-2003 worldwide Zyvox Annual App raisal of Potency and Spectrum(ZAAPS)Program[J].Int JAntimicrob Agents,2005,26(1):13-21.

[3] YUKIKO K,STRANGER-Jones,TAEOK Bae,et al.Vaccine assembly from surface proteins of Staphylococcus aureus[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(45):16 942-16 947.

[4] MAZMANIAN SK,SKAAR E P,GASPAR A H,et al.Passage of heme-iron across the envelopeof Staphylococcus aureus[J].Science,2003,299(5 608):906-909.

[5] SKAAR E P,SCHNEEW INDO.Iron-regulated surface determinants(Isd)of Staphylococcus aureus:stealing iron from heme[J].Microbes Infect,2004,6(4):390-397.

[6] KUKLIN N A,CLARK D J,SECORE S,et al.A novel Staphylococcus aureus vaccine:iron surface determ inant B induces rapid antibody responses in rhesusmacaques and specific increased survival in amurine S.aureus sepsis model[J].Infect Immun,2006,74(4):2 215-2 223.

[7] TORRESV J,PISHCHANYG,HUMAYUN M,etal.Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization[J].JBacteriol,2006,188(24):8 421-8 429.

[8] 薩姆布魯克·J,弗里奇·E·F,曼尼阿蒂斯·T.分子克隆實驗指南[M].金冬雁,黎孟楓,譯.第 2版.北京:科學出版社,1999.

(責任編輯:朱寶昌)