化石利膽湯對(duì)ERCP術(shù)后膽總管結(jié)石患者CYP7A1和B-UGT影響研究

鞏 陽(yáng)，林一帆△，王長(zhǎng)洪，王立新，麻樹(shù)人，陸宇平，高文艷，劉 楊，季 芳

膽石癥是一種常見(jiàn)病，在我國(guó)膽總管結(jié)石的發(fā)病率較高，占全國(guó)膽結(jié)石患者的5% ～29%，平均18%［1］。目前主要采取外科手術(shù)或內(nèi)科介入治療膽總管結(jié)石，安全、有效，但術(shù)后患者結(jié)石再發(fā)幾率高，約為6.4% ～18%［2］，所以膽總管結(jié)石的再發(fā)給病人帶來(lái)很大的負(fù)擔(dān)，如何防治膽總管結(jié)石已成為當(dāng)前的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。近年來(lái)，我們通過(guò)應(yīng)用加減化石利膽湯治療膽總管結(jié)石療效顯著［3］，為進(jìn)一步探討此湯劑對(duì)成石機(jī)制的影響，我們展開(kāi)以下研究。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

本組100例患者均為來(lái)自沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院中醫(yī)科2009年9月至2010年10月的住院患者，男58例，女42例，年齡28歲至80歲，平均56歲±26歲。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn) (1)超聲或腹部 CT、MRI、MRCP等明確診斷為膽總管結(jié)石;(2)經(jīng)ERCP取石術(shù)后;(3)術(shù)前1個(gè)月內(nèi)未服用利膽藥物。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) (1)肝硬化;(2)免疫性疾病;(3)嚴(yán)重腎臟疾病;(4)膽道狹窄;(5)十二指腸乳頭良性狹窄的患者。

1.2 材料

1.2.1 試劑 化石利膽湯藥物組成:茵陳30g，威靈仙 10g，金錢草 30g，厚樸 15g，枳實(shí) 15g，梔子 10g，柴胡10g，雞內(nèi)金15g，莪術(shù)15g，均由沈陽(yáng)軍區(qū)總醫(yī)院中藥局提供，廣東一方制藥廠生產(chǎn);焦炭酸二乙酯(DEPC)，由博爾美生物制劑公司提供;人血RNA提取試劑盒、Taq聚合酶(5U/ul)，寶生物工程(大連)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄酶、核糖核酸抑制劑、DNA標(biāo)記物(DL2000)、CYP7A1、B-UGT 抗體，SIGMA 公司。

1.2.2 主要儀器 －85℃型號(hào)超低溫冰箱(德國(guó)Hereaus公司);PCR基因擴(kuò)增儀(美國(guó) Bio-Rad公司);紫外線投射反射照相儀與計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.3 方法

1.3.1 分組按隨機(jī)非雙盲(隨機(jī)號(hào)碼數(shù)字表法1∶1入組) 服藥組50例和對(duì)照組50例，兩組病人在年齡、性別、病情、病程差異上均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。服藥組于ERCP取石術(shù)后常規(guī)給予抗炎、保肝、抑酸、抑酶等西醫(yī)治療，于術(shù)后第1d給予加減化石利膽湯100ml口服，3次/d，餐后30min服藥，連續(xù)口服1個(gè)月。對(duì)照組于ERCP取石術(shù)后除上述常規(guī)西醫(yī)治療外不給予任何其他治療，2組患者術(shù)后飲食均合理配餐，均衡膳食。

1.3.2 標(biāo)本采集 2組均于患者行ERCP取石術(shù)后第1天，服藥后第7天及1個(gè)月采血，常規(guī)靜脈采全血2ml于含EDTA抗凝負(fù)壓抽血管中，顛倒混勻保存于－70℃冰柜;且每個(gè)患者均在術(shù)后留置鼻膽管，遂在術(shù)后第1、7天留取清晨空腹時(shí)鼻膽管膽汁，去除被血液污染或呈明顯膿性的膽汁標(biāo)本，于－20℃冰箱保存。血及膽汁中指標(biāo)的檢測(cè)均在沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院完成。

1.3.3 血mRNA檢測(cè) Trizol方法提取血液白細(xì)胞中總 RNA，反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA，配制反應(yīng)體系:MgCl2(25mM)6μl，10 × RNA PCR Buffer 8μl，滅菌蒸餾水 63.5μl，TaKaRa Taq(5U/μl)0.5μl，上游PCR引物1μl，下游 PCR 引物 1μl。引物序列為:人膽紅素尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(bilirubin UDP-glucronosyltransferase，B-UGT):上 游 引 物 5'-GAATTTGAAGCCTACATTAATGCTTCTGGAGAACAT-3'和下游引物5'-TCACATCTGTCTTCCTGACTGC-3'，引物擴(kuò)增產(chǎn)物為546bp片段;人膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)，上 游 引 物 5’F-GCCCAACTAG AGAATCTCTG -3'和下游 引物 5'FAGATGTACAACATCTCATTC-3'。GAPDH:上 游 引物5'-TATTGGGCGCCTGGTCACCA-3'和下游引物5'-CCACCTTCTTGATGTCATCA-3'，引物擴(kuò)增產(chǎn)物為726bp片段。

把上述80ul反應(yīng)液加入到20μl反轉(zhuǎn)錄結(jié)束后的PCR反應(yīng)管中，輕輕混勻，按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng):變性 94℃ 30sec，退火 48℃ 30sec，延長(zhǎng) 72℃1.5min，30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物在含0.5mg/L EB的1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)作密度分析，目的基因的表達(dá)通過(guò)GAPDH的表達(dá)量作標(biāo)準(zhǔn)化處理，即半定量，然后計(jì)算各標(biāo)本目的基因表達(dá)半定量的比值，各標(biāo)本重復(fù)3次取均值。

1.3.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 細(xì)胞收集于EP管中，加入蛋白裂解液和蛋白酶抑制劑，超聲破碎細(xì)胞，離心后提取蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度，蛋白上樣量為80μg，體系為20μl。配制12%聚丙烯酰胺凝膠，煮樣后電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉(5%脫脂牛奶)，一抗4℃孵育過(guò)夜(CYP7A1為1∶500稀釋，B-UGT為1∶500稀釋)，洗膜45min，加入過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2h后electrochemiluminescence(ECL)發(fā)光，應(yīng)用Metamorph軟件計(jì)算光密度值。將每組服藥前空白組的光密度值設(shè)為參考值，將其他組的光密度值與其相比得到的比值，即半定量，各標(biāo)本重復(fù)3次，取均值。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以第三方盲態(tài)評(píng)價(jià)法，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，采用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)軟件，χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人血CYP7A1、B-UGT mRNA表達(dá)變化

比較2組治療前 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表達(dá)，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。服藥組服藥后第7天、1個(gè)月 CYP7A1、B-UGT的 mRNA表達(dá)明顯強(qiáng)于服藥前，明顯強(qiáng)于同一時(shí)期對(duì)照組(P＜0.05，表1圖 1、2)，而對(duì)照組服藥前后 CYP7A1、B-UGT mRNA的表達(dá)無(wú)差異。

2.2 人膽汁中CYP7A1、B-UGT蛋白表達(dá)變化

比較2組治療前CYP7A1、B-UGT的蛋白表達(dá)，無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。服藥組服藥后第7d CYP7A1、B-UGT的蛋白表達(dá)明顯強(qiáng)于服藥前，明顯強(qiáng)于同一時(shí)期的對(duì)照組(P＜0.05，表2圖3、4)，對(duì)照組服藥前后膽汁中的 CYP7A1、B-UGT的蛋白表達(dá)無(wú)差異。

表1 不同時(shí)期兩組病人血中CYP7A1、B-UGTm RNA表達(dá)

3 討論

圖1 血B-UGT m RNA表達(dá)變化

圖2 血CYP7A1 m RNA表達(dá)變化

表2 不同時(shí)期兩組病人膽汁CYP7A1、B-UGT蛋白表達(dá)

膽結(jié)石按成石部位分類，可分為膽囊結(jié)石、肝內(nèi)膽管結(jié)石、膽總管結(jié)石，其中膽總管結(jié)石的治療主要以ERCP等內(nèi)鏡介入治療為主，且取石的成功率也越來(lái)越高，但膽總管結(jié)石的復(fù)發(fā)問(wèn)題仍是難點(diǎn)，目前能夠防石、溶石的西藥的報(bào)道主要為去氧膽酸等一類藥物，但因其價(jià)格昂貴，療效不明確，應(yīng)用受限。

中醫(yī)藥治療膽石癥歷史悠久，且療效顯著，近年來(lái)中醫(yī)藥學(xué)者結(jié)合現(xiàn)代醫(yī)學(xué)技術(shù)對(duì)多種中藥給予深入研究。如有文獻(xiàn)報(bào)道中藥升清膠囊可以干預(yù)大鼠肝組織中成石基因，即 B-UGTmRNA 和CYP7AlmRNA的表達(dá)，進(jìn)一步干預(yù)膽紅素和膽固醇代謝，抑制致石性膽汁形成，起到預(yù)防膽結(jié)石的作用［4］。但中醫(yī)藥對(duì)于膽石癥的成石基因研究只有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，無(wú)臨床實(shí)驗(yàn)研究，且尚無(wú)從膽汁或血液研究成石基因及其蛋白的表達(dá)。所以本課題從分子生物學(xué)方面研究加減化石利膽湯防治膽總管結(jié)石的機(jī)制，以便更好地指導(dǎo)預(yù)防工作。

膽結(jié)石的形成過(guò)程中，膽紅素和膽固醇為重要的成石物質(zhì)，因?yàn)樗鼈兎謩e是膽紅素和膽固醇代謝過(guò)程中重要的酶，B-UGT和 CYP7A1mRNA為2個(gè)重要的成石基因。膽結(jié)石根據(jù)形成的主要成分，可分為膽紅素結(jié)石、膽固醇結(jié)石、混合型結(jié)石。膽紅素結(jié)石的主要成分是游離膽紅素，所以游離型膽紅素對(duì)成石有重要意義［5］，而游離膽紅素是結(jié)合膽紅素水解后形成的，這個(gè)水解的過(guò)程主要依靠葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶(B-UGT)，所以膽汁中游離膽紅素的含量與B-UGT密切相關(guān)，于是 B-UGT的 mRNA表達(dá)水平可反映膽紅素結(jié)石的形成趨勢(shì)［6］。膽固醇結(jié)石中的主要物質(zhì)是膽固醇，內(nèi)源性的膽固醇代謝主要通過(guò)經(jīng)典途徑被代謝成膽汁酸，膽固醇7α羥化酶(CYP7A1)即是經(jīng)典途徑的起始酶，所以CYP7A1的活性代表著機(jī)體清除膽固醇的能力，也是膽固醇結(jié)石形成中重要的成石因素［7］。所以，監(jiān)測(cè) B-UGT和CYP7A1mRNA的表達(dá)和蛋白表達(dá)，可以在很大程度上說(shuō)明膽石成石趨勢(shì)。

圖3 膽汁B-UGT蛋白表達(dá)變化

圖4 膽汁CYP7A1蛋白表達(dá)變化

本課題組長(zhǎng)期以來(lái)從事ERCP結(jié)合中醫(yī)藥治療膽總管結(jié)石的研究，其病例近2000人。10余年來(lái)，我們?cè)谂R床觀察中發(fā)現(xiàn)，口服化石利膽湯可以治療膽總管結(jié)石，且本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了口服化石利膽湯的患者血中B-UGT和CYP7A1的mRNA表達(dá)及膽汁中B-UGT和CYP7A1的蛋白表達(dá)明顯高于空白對(duì)照組，從而表明化石利膽湯很可能通過(guò)上調(diào)B-UGT和CYP7A1基因表達(dá)，使B-UGT和CYP7A1的蛋白表達(dá)增加，以減少結(jié)石形成。中藥對(duì)于膽總管結(jié)石進(jìn)一步預(yù)防的研究，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行長(zhǎng)期的藥物臨床觀察，并對(duì)照相關(guān)膽石成石基因表達(dá)，選取有效的膽總管結(jié)石中藥。

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