消渴益腎方對糖尿病腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的研究

張 潔

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病(diabetes Mellitus，DM)最常見的并發(fā)癥，也是導(dǎo)致終末期腎病的主要原因，目前尚無特效的治療辦法。以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，用中醫(yī)藥對糖尿病腎病進(jìn)行防治，取得了一定的效果，顯示出廣闊的前景。消渴益腎方是我院的協(xié)定方，臨床應(yīng)用多年，效果良好。在臨床應(yīng)用的基礎(chǔ)上開展了實驗研究，采用單側(cè)腎切除合并STZ誘導(dǎo)的DN模型，觀察其對主要生化指標(biāo)的影響，探討其作用機制，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 純種雄性 Wistar大鼠，體重180g～220g，周齡6～8周，由山東大學(xué)實驗動物中心提供(動物合格證號SCXK(魯)120030012)。

1.1.2 藥物 消渴益腎方(黃芪30g，熟地黃20g，山藥 12g，山茱萸 12g，枸杞子 12g，茯苓 20g，白術(shù)10g，澤蘭10g，水蛭6g)，由濰坊市中醫(yī)院藥劑科提供。以上中藥加10倍水浸泡2h煎煮，水沸后小火煎30min，過濾取汁;第2次加8倍水，重復(fù)上述操作，合并濾液濃縮成200%的藥液(每毫升藥液含2 g生藥)，冷卻后密封4℃保存。纈沙坦(80 mg/片，諾華公司生產(chǎn))，實驗動物用劑量:20 mg/kg，臨用前用蒸餾水配制成混懸液，4℃保存。

1.1.3 試劑及儀器 鏈脲佐菌素(STZ)購自Sigma公司;大鼠血清轉(zhuǎn)化生長因子 β1(TGF-β1)ELISA試劑盒，BPB公司(批號70621S);大鼠血清纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)ELISA試劑盒，BPB公司(批號2005060113);空腹血糖(FPG)測定試劑盒，德賽診斷系統(tǒng)有限公司;血膽固醇(TC)、甘油三脂(TG)、血尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)測定試劑盒，北京利德曼生化技術(shù)有限公司。7170S型自動分析儀，日本日制產(chǎn)業(yè)株式會社。

1.2 方法

1.2.1 動物模型的建立 按 Anderson等［1］建立的方法，將50只大鼠戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)后，左側(cè)臥位固定，在脊柱與肋骨交界處備皮，剪開皮膚后鈍性分離肌肉層，用手將右腎抵出切口，止血鉗夾住腎血管，鈍性剝離腎包膜，保留腎上腺，結(jié)扎血管后將右腎摘除，分別縫合肌肉和皮膚。假手術(shù)組分離肌肉層后再進(jìn)行縫合即可。每只老鼠肌肉注射青霉素50U/d，3d。2周后切口完全愈合。

將大鼠空腹24h后，取10只作為假手術(shù)組，其余按45mg/kg腹腔一次性注射STZ，假手術(shù)組只注射相同體積的枸椽酸緩沖液，72h后尾尖取血，血糖儀測定血糖 ＞16.7mmol/L者確定為糖尿病模型。符合條件的大鼠共36只。

1.2.2 分組及給藥方法 36只大鼠隨機分為3組:模型對照組(生理鹽水，3 ml/只);纈沙坦組(纈沙坦20mg/(kg·d)灌胃);消渴益腎方 +纈沙坦組(消渴益腎方1.015g/kg;纈沙坦20mg/(kg·d)，灌胃)。假手術(shù)組(生理鹽水，3 ml/只)。根據(jù)體表面積劑量換算法確定給藥劑量［2］，按1 ml/100 g體質(zhì)量灌胃，每天1次，實驗期間自由進(jìn)食、飲水。觀察8周。

1.2.3 指標(biāo)測定 于第8周末，用代謝籠收集24h尿液檢測尿白蛋白;然后禁食12h，動物用戊巴比妥鈉腹腔麻醉(40mg/kg)固定，腹主動脈取血測FPG、BUN、Cr、TC、TG、TGF-β1、PAI-1。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)方法 數(shù)值變量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(珋x±s)表示，運用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，如果正態(tài)并方差齊則采用單因素方差分析檢驗，如不齊，則采用秩和檢驗。分類變量應(yīng)用成組設(shè)計多個樣本比較的秩和檢驗。以α=0.05為檢驗水準(zhǔn)。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠生活習(xí)性的變化

表1顯示，造模成功的大鼠均有不同程度的毛色暗淡，精神萎靡，體重減輕，并出現(xiàn)多食多飲多尿現(xiàn)象。隨著實驗進(jìn)展，用藥組大鼠體重逐漸增加，多食多飲多尿現(xiàn)象緩解，模型對照組及假手術(shù)組大鼠生活習(xí)性及體重?zé)o明顯變化。

2.2 各組大鼠血糖、血脂、腎功能的變化

表2顯示，大鼠8周給藥結(jié)束后，血糖測定結(jié)果顯示，模型組和治療組與假手術(shù)組相比均差異顯著(P＜0.01)，模型組與各治療組之間無明顯差異(P＞0.05)。各組大鼠血TC、TG未見統(tǒng)計學(xué)差異。模型組血 BUN、Cr高于假手術(shù)組(P＜0.01)，用藥組較模型組有所下降(P＜0.05)，中藥聯(lián)合纈沙坦作用明顯優(yōu)于單用纈沙坦(P＜0.05)。

2.3 各組大鼠 24h尿白蛋白、TGF-β1、PAI-1的變化

表1 各組大鼠體重及不同階段攝食量飲水量變化表(珋x±s)

表2 各組大鼠血糖、血脂、腎功能的比較(珋x±s)

表3顯示，模型組大鼠尿中白蛋白含量明顯高于假手術(shù)組(P＜0.01)，2個給藥組均能夠抑制白蛋白的排出，其差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)，其中，中藥聯(lián)合纈沙坦組的作用優(yōu)于單用纈沙坦組(P＜0.05)。與假手術(shù)組相比，模型組 TGF-β1、PAI-1明顯增高，其結(jié)果具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。各治療組與模型組相比，均顯示出了對TGF-β1、PAI-1分泌的抑制作用(P＜0.01)，消渴益腎方組的作用優(yōu)于纈沙坦組(P＜0.05)。

表3 各組大鼠24h尿蛋白、TGF-β1、PAI-1的比較(珋x±s)

3 討論

糖尿病可通過多條途徑促使糖尿病腎病的形成，每條途徑既可單獨致病，又可通過影響其他途徑致病，各途徑之間?？上嗷ゴ龠M(jìn)，并在致病過程中產(chǎn)生協(xié)同作用。在整個實驗期間，大鼠血糖持續(xù)保持在較高水平，尿白蛋白排出，血 BUN、Cr均顯著增加，證實切除糖尿病大鼠一側(cè)腎臟能夠造成對側(cè)腎臟的高灌注和高濾過，能顯著加重糖尿病腎臟病變。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，糖尿病腎病的病機關(guān)鍵為氣陰兩虛、脾腎雙虧、水瘀內(nèi)阻，故治療上以標(biāo)本兼治為原則，以健脾益氣、補益肝腎、活血利水為治療大法。方中黃芪、茯苓、白術(shù)益氣健脾;山藥補脾，又能益腎固精，止漏濁;山茱萸補肝腎澀精止遺;熟地、枸杞子滋補腎陰;澤蘭、水蛭活血利水;諸藥合用恰合糖尿病腎病的病機。藥理研究顯示，黃芪、茯苓、白術(shù)［3］有利尿消腫作用，黃芪［4］通過調(diào)節(jié)腎小球疾病蛋白質(zhì)代謝紊亂，提高血漿白蛋白水平，降低尿蛋白;茯苓［5］的主要活性成分是茯苓素，可競爭醛固酮受體，體內(nèi)逆轉(zhuǎn)醛固酮效應(yīng)，有利于水腫患者尿液的排出，恢復(fù)腎功能，消除尿蛋白;山藥［3］能恢復(fù)腎功能，減少蛋白尿;熟地黃［6］中的地黃寡糖能夠降低血糖，改善糖脂代謝;枸杞子［3］的主要成分是枸杞多糖，能夠增強免疫力，降低血糖;澤蘭［7］、水蛭［3］、山茱萸［3］能抑制血小板聚集，抗血栓形成，對糖尿病腎病起到改善循環(huán)的作用，諸藥聯(lián)用，共同發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

蛋白尿為DN的一個顯著特征，因此蛋白尿能否下降也成為觀察藥物對DN療效的敏感指標(biāo)。本實驗中，DN模型大鼠尿白蛋白排出量的增加明顯高于正常組，2個給藥組均能夠抑制尿白蛋白的排出，其中消渴益腎方組的作用明顯優(yōu)于單用纈沙坦組。

實驗結(jié)果顯示，模型組BUN、Cr均高于正常組，用藥治療后均有所下降，消渴益腎方組下降更為明顯(P＜0.05)，說明消渴益腎方通過降低 BUN、Cr水平，改善腎功能，起到保護(hù)腎臟作用。

在DN的發(fā)病機制中，細(xì)胞因子被認(rèn)為起著非常重要的作用，其中，TGF-β1的作用日益受到重視，有人認(rèn)為，它是各種腎臟損傷因素的共同中介物，是腎小球硬化過程中細(xì)胞因子紊亂的核心［8］，它介導(dǎo)腎小球肥大及細(xì)胞外基質(zhì)的堆積，直接參與DN的病理發(fā)生。在本實驗中發(fā)現(xiàn)，與假手術(shù)組相比，模型大鼠血清 TGF-β1有明顯升高，各治療組對 TGF-β1的分泌具有抑制作用，中藥干預(yù)組更加明顯，提示2個藥物可能通過不同的通路抑制 TGF-β1高表達(dá)，表現(xiàn)出協(xié)同作用，從而發(fā)揮更好的腎臟保護(hù)作用。PAI-1的沉積參與了腎小球病變的發(fā)展過程和腎小球硬化的發(fā)生機制。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，DN模型組大鼠血清PAI-1活性升高，導(dǎo)致纖溶活性降低，應(yīng)用消渴益腎方、纈沙坦治療可以降低血清中PAI-1的含量，2個藥物聯(lián)合應(yīng)用效果更好。

綜上所述，消渴益腎方能夠通過多種途徑改善腎功能，降低蛋白尿，延緩腎小球硬化，發(fā)揮腎臟保護(hù)作用。

［1］ Anderson S，Rennke HG，Brenner BM.Nifedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats［J］.Kidney Int，1992，41(4):891-7.

［2］ 賀石林，王健，王凈凈.中醫(yī)科研設(shè)計與統(tǒng)計學(xué)［M］.湖南:湖南科學(xué)技術(shù)出版社，2001.48-49.

［3］ 李希新，蘇明廉.當(dāng)代中藥臨床應(yīng)用［M］.山東:濟南出版社，1994.530，680，685，795，820.

［4］ 周 欽.黃芪對腎小球疾病物質(zhì)代謝紊亂的調(diào)節(jié)作用［J］.中草藥，1999，30(5):386.

［5］ 金 琦，曹靜，王淑華.大劑量茯苓的藥理作用及臨床應(yīng)用概況［J］.浙江中醫(yī)雜志，2003，38(9):410-411.

［6］ 曾 艷，賈正平，張汝學(xué)，等.地黃寡糖在2型糖尿病大鼠模型上的降血糖作用及機制［J］.中國藥理學(xué)通報，2006，22(4):411-415.

［7］ 石宏志.澤蘭有效成分對血小板聚集和血栓形成的影響［J］.中草藥，2003，34(10):923-926.

［8］ Pantsulaia T.Role of TGF-beta in pathogenesis of diabetic nephropathy［J］.Georgian Med News，2006，(131):13-8.