一種KBMA炭疽疫苗候選株的研制

沈非，袁盛凌，展德文，王艷春，任敏,，陶好霞，王芃，王令春，陳冬生，劉純杰

1 安徽師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，蕪湖 241000

2 中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院 生物工程研究所 病原微生物與生物安全國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100071

炭疽芽胞桿菌是一種能形成芽胞的革蘭氏陽性菌，它引起的炭疽病是一種人畜共患的傳染病，炭疽可通過皮膚、呼吸道、胃腸道三種方式侵害人類，因此嚴(yán)重地影響到人類的健康。在我國，據(jù)衛(wèi)生部報道，僅2007年就有近400例發(fā)生 (1例死亡)[1]。同時炭疽芽胞桿菌芽胞可以氣溶膠的形式傳播，當(dāng)前的主要威脅是生物戰(zhàn)劑和生物恐怖襲擊！

炭疽芽胞桿菌攜帶 2個毒性質(zhì)粒。一個是質(zhì)粒pXO1，編碼炭疽毒素 3個毒力因子：保護(hù)性抗原(Protective antigen，PA)、致死因子 (Lethal factor，LF) 和水腫因子 (Edema factor，EF)；另一個毒性質(zhì)粒pXO2中則含有5個與莢膜形成相關(guān)的基因，它們分別是capA、capB、capC、capD和capE[2]。炭疽芽胞桿菌AP422 (pXO1?pXO2?) 是一株不含有2個毒性大質(zhì)粒的菌株，其毒性比我國的炭疽芽胞桿菌A16R (pXO1+pXO2?) 疫苗株明顯減弱[3]。

從研究方法看，目前應(yīng)用的疫苗有兩類：一類是俄羅斯和中國用的是減毒活芽胞苗 (B. anthracis CTИ和A16R strain)，減毒活芽胞苗A16R通過皮下劃痕接種，保護(hù)率為 80%以上。但對肺炭疽的保護(hù)效果不佳，并具有一定的不良反應(yīng)，如頭暈、耳鳴、心悸、四肢乏力等，嚴(yán)重者可導(dǎo)致暈厥、四肢抽搐和呼吸困難。另一類是美國用的鋁膠吸附苗 (AVA)，它是一種經(jīng)氫氧化鋁吸附和福爾馬林處理的炭疽芽胞桿菌V770-NPI-R株的上清液鋁膠苗。注射這種疫苗能夠有效地刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性結(jié)合毒素的抗體，但它的制備產(chǎn)量有限，免疫效果不理想，要進(jìn)行 6次皮下注射，整個免疫程序長達(dá) 18個月之久，因?yàn)V液中除PA外，還含有EF和LF及其他物質(zhì)，所以會有少數(shù)免疫者呈現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，副作用大，輕度局部反應(yīng)達(dá) 30%，約 0.2%接種者呈全身反應(yīng)，癥狀表現(xiàn)為乏力、發(fā)熱和寒顫[2,4-5]。

目前，炭疽疫苗的主要研究思路仍然圍繞著PA展開的，許多研究者認(rèn)為PA加其他菌體或芽胞組分是一個比較理想的炭疽疫苗研究策略。如PA加滅活的芽胞、PA加芽胞蛋白、PA加減毒菌株、PA加莢膜多糖和 PA結(jié)構(gòu)域加毒素結(jié)構(gòu)域等。大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，這種多組分疫苗能起到更好的免疫保護(hù)作用[6-11]。

KBMA疫苗在炭疽桿菌疫苗的研究中剛剛嶄露頭角。研究者在細(xì)菌疫苗研究中，發(fā)現(xiàn)缺失基因uvrA、uvrB、uvrC的細(xì)菌在被補(bǔ)骨脂素 (Psoralen)和長波紫外光 (UVA) 光化學(xué)處理 (Photochemical treatment，PCT) 后，菌體雖然失去繁殖能力，但體內(nèi)代謝活性卻仍然維持[12-14]。它的主要機(jī)制是：細(xì)菌的uvrA、uvrB、uvrC基因在PCT后能誘發(fā)表達(dá)核酸修復(fù)酶ABC，此酶能夠切除修復(fù)被Amotosalen (補(bǔ)骨脂素衍生物) 發(fā)生交聯(lián)而受損傷的的 DNA和RNA片段，當(dāng)細(xì)菌缺失uvrA、uvrB、uvrC任何一種基因時，在PCT作用下，核酸切除修復(fù)不能完成，因此細(xì)菌將很快失去繁殖能力，但體內(nèi)代謝活性卻能維持[14-17]。據(jù)文獻(xiàn)報道[12,14]，KBMA疫苗在動物的免疫和安全評價中，相比目前的減毒活疫苗安全性增強(qiáng)；相比AVA免疫效果要好和免疫周期要縮短；而且相比其他亞單位疫苗或滅活疫苗免疫效果要好。因此對KBMA候選株的研究具有潛在應(yīng)用價值。本實(shí)驗(yàn)是通過同源重組的方法利用溫敏型質(zhì)粒pMAD[18]和Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)[19]敲除uvrAB基因從而成功制備了KBMA炭疽芽胞桿菌，它為我國研制新型炭疽疫苗提供了新的候選株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

文中使用的主要菌株和質(zhì)粒見表1。

1.1.2 主要試劑

基因組提取試劑盒為天根公司產(chǎn)品；pfu、Taq酶，大腸桿菌DH5α、scs110，T載體及其他PCR相關(guān)試劑為 Transgen公司產(chǎn)品；限制性內(nèi)切酶和 T4 DNA連接酶為NEB公司產(chǎn)品；抗生素購自Merck公司；IPTG和 X-gal均為 Amresco公司產(chǎn)品；TRIzol為Invitrogen公司產(chǎn)品；反轉(zhuǎn)錄酶為Toyobo公司產(chǎn)品；8-甲氧基補(bǔ)骨脂素 (8-MOP) 為北京華威銳科化工公司產(chǎn)品；腦心浸液 (BHI) 培養(yǎng)基為BD公司產(chǎn)品；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒及代謝活性檢測試劑盒購自Promega公司；PCR引物合成和序列測定由華大公司完成，所用引物序列見表2。

表1 主要菌株與質(zhì)粒Table 1 Strains and plasmids

表2 本次實(shí)驗(yàn)用的全部引物 (靶基因：uvrAB基因，位置：4 885 594 bp~4 890 452 bp)Table 2 Primers used in this study (Target gene: uvrAB gene and Site: 4 885 594 bp?4 890 452 bp)

1.2 方法

1.2.1 PCR擴(kuò)增上下游同源臂片段及鑒定

從GenBank中收錄的B. anthracis基因組序列中找到uvrAB基因序列，用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)上游同源臂的引物：uvrAB-U F，uvrAB-U R和下游同源臂引物：uvrAB-D F，uvrAB-D R并合成。提取炭疽芽胞桿菌AP422基因組，以它為模板，用pfu酶擴(kuò)增上下游同源臂uvrAB-U和uvrAB-D，反應(yīng)體系為50 uL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min ，5個循環(huán)；94 ℃ 30 s，61 ℃30 s，72 ℃ 1 min，27個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增完畢后，凝膠電泳檢測結(jié)果，直接切膠回收純化同源臂片段，連接到T載體上，進(jìn)行雙酶切檢定和測序。

1.2.2 pT-uvrABUD::spc載體的構(gòu)建

用酶BamHⅠ和SacⅡ，EcoRⅠ和XhoⅠ分別依次從連接正確的 T載體上雙酶切下上下游同源臂uvrAB-U和uvrAB-D，并純化，同樣用此酶依次雙酶切質(zhì)粒pT-loxP::spc，然后依次用T4 DNA連接酶將同源臂片段16 ℃過夜連接到質(zhì)粒pT-loxP::spc上，構(gòu)建成pT-uvrABUD::spc載體。

1.2.3 打靶載體pMAD-uvrABUD::spc的構(gòu)建

用酶BamHⅠ和 XhoⅠ對質(zhì)粒pT-uvrABUD::spc進(jìn)行雙酶切，然后切膠回收并純化 uvrAB-U-spc-uvrAB-D片段，同樣用酶 BamHⅠ和 SalⅠ對質(zhì)粒pMAD進(jìn)行雙酶切，用T4 DNA連接酶將酶切片段 uvrAB-U-spc-uvrAB-D 16 ℃過夜連接到質(zhì)粒pMAD上，構(gòu)建成pMAD-uvrABUD::spc載體。

1.2.4 炭疽芽胞桿菌AP422感受態(tài)細(xì)胞的制備

用試劑1 (BHI containing 0.5% glycerol) 37 ℃培養(yǎng)炭疽芽胞桿菌AP422，OD600達(dá)到 0.6時，將菌液冰浴10 min，4 ℃、8 000×g離心2 min，去上清。用冰冷的試劑2 (1 mmol/L HEPES，10% glycerol，pH 7.0) 重懸菌液，重復(fù)2遍，最終用試劑2定容菌液到100 μL，直接使用或?80 ℃儲存?zhèn)溆肹20]。

1.2.5 炭疽芽胞桿菌AP422菌株uvrAB基因的“無痕”敲除

按照文獻(xiàn)[12]所述，將去甲基化的打靶載體pMAD-uvrABUD::spc電擊轉(zhuǎn)入炭疽芽胞桿菌AP422感受態(tài)細(xì)胞中，使打靶片段 uvrAB-U-LoxP-spc-LoxP-uvrAB-D與AP422基因組上的部分uvrAB基因發(fā)生同源重組，敲除uvrAB基因；然后再將質(zhì)粒pHY-Cre電擊轉(zhuǎn)入敲除uvrAB基因的AP422中，去除壯觀霉素 (Spc) 抗性基因，最終實(shí)現(xiàn)“無痕”敲除uvrAB基因的AP422，即AP422 △ uvrAB 。

1.2.6 AP422△ u vrAB 的PCR鑒定

對于 AP422 及帶 spc 抗性重組菌AP422 △ uvrAB::spc和AP422△ uvrAB菌株，提取基因組作為模板，用炭疽芽胞桿菌基因組上下游同源臂外側(cè)設(shè)計(jì)的引物uvrAB-Uw F和uvrAB-Dw R進(jìn)行PCR鑒定，體系為20 μL，反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。并對PCR產(chǎn)物連接到T載體后進(jìn)行測序鑒定。

1.2.7 AP422△ u vrAB的RT-PCR鑒定

將AP422△ uvrAB和AP422菌株在BHI液中37 ℃培養(yǎng)6 h，取1.5 mL培養(yǎng)物 (約109CFU)，離心取上清收集菌體，加入200 μL溶菌酶 (20 mg/mL)混勻37 ℃處理1 h，然后按說明書要求用TRIzol提取RNA，再測定其濃度，取1 μg作為模板，利用隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄合成cNDA第一鏈，然后再以此cDNA作為模板，使用同源臂內(nèi)側(cè)設(shè)計(jì)的引物uvrAB F和uvrAB R進(jìn)行RT-PCR分析，反應(yīng)條件同上。

1.2.8 AP422△ u vrAB菌株生長曲線的測定

炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB和AP422菌株37 ℃過夜培養(yǎng)后，以1∶100轉(zhuǎn)接至200 mL BHI三角燒瓶中，37 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔1 h測一次OD600值。

1.2.9 AP422△ u vrAB菌株對PCT的敏感性測定

AP422△ uvrAB菌液在BHI液中37 ℃培養(yǎng)，OD600達(dá)到0.6時，加入8-MOP (1 μg/mL)，37 ℃孵育1 h，然后按紫外照射時間將菌液分6個組，每組做一復(fù)孔，以每孔2 mL菌液加入12孔細(xì)胞板中，1 700 μW/cm2紫外燈下分別照射10、20、30、40、50、60 min，照射距離為6 cm，然后進(jìn)行殘留活菌計(jì)數(shù)。同時，分別用加有8-MOP (1 μg/mL和10 μg/mL) 的AP422菌液作為對照。

1.2.10 KBMA AP422△ u vrAB代謝活性的檢測

按照此前方法，1 700 μW/cm紫外燈下照射菌液1 h后 (6 J/cm2)。用CellTiter 96 Aqueous Assay試劑盒測定代謝活性。在 96孔板中加入 20 μL MTS/PMS混合溶液和 100 μL稀釋后的 PCT菌液(1×106CFU)，混勻，37 ℃孵育，每隔30 min在492 nm 下用酶標(biāo)儀測一次吸光度。同時用 PCT (8-MOP，10 μg/mL) 的AP422菌液和不做PCT的活菌：AP422△ uvrAB 、AP422菌液作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 上下游同源臂片段的獲得

同源臂是基因片段間發(fā)生同源重組的重要“橋梁”，PCR擴(kuò)增同源臂片段大小為：上游同源臂uvrAB-U 是625 bp，下游同源臂uvrAB-D是658 bp。上游同源臂兩端有兩個酶切位點(diǎn)：BamHⅠ和SacⅡ，下游同源臂兩端也有兩個酶切位點(diǎn)：EcoRⅠ和XhoⅠ。PCR擴(kuò)增出的上下游同源臂片段純化后連到T載體上，經(jīng)過雙酶切鑒定正確 (圖1) 和測序鑒定正確。

2.2 炭疽芽胞桿菌AP422菌株uvrAB基因的“無痕”敲除

圖1 PCR擴(kuò)增出的上下游同源臂與雙酶切鑒定Fig. 1 PCR amplification of homologous arms and restriction enzyme analysis of homologous arms. (A) M: DNA marker; 1: upstream homologous arm, 625 bp; 2: downstream homologous arm, 658 bp. (B) M: DNA marker; 1: restriction enzyme analysis of upstream homologous arm; 2: restriction enzyme analysis of downstream homologous arm.

pMAD是溫敏型質(zhì)粒，不僅可以在 X-gal催化下生成藍(lán)白斑，提高篩選效率，還可以在溫度≥40 ℃去除該質(zhì)粒。我們先利用pMAD質(zhì)粒構(gòu)建成打靶載體pMAD-uvrABUD::spc，然后在Spc抗性壓力下促進(jìn)同源重組；再利用pHY-Cre質(zhì)粒表達(dá)的Cre重組酶識別loxP位點(diǎn)，去除重組后遺留在炭疽芽胞桿菌AP422基因組上的 Spc抗性基因，最終實(shí)現(xiàn) uvrAB基因的“無痕”敲除 (圖2)。

圖2 炭疽芽胞桿菌AP422菌株通過Cre-loxP重組酶系統(tǒng)敲除uvrAB基因示意圖Fig. 2 Schematic model showing the knockout of the uvrAB gene of B. anthracis AP422 by Cre-loxP system.

2.3 AP422△uvrAB菌株的PCR鑒定

理論上用引物uvrAB-Uw F和uvrAB-Dw R擴(kuò)增uvrAB基因片段大小：原始菌株AP422為4 648 bp，重組菌AP422 △ uvrAB::spc為2 751 bp，“無痕”敲除株AP422△ uvrAB為1 621 bp。這和圖3A中相一致，從基因水平上說明在炭疽芽胞桿菌 AP422的uvrAB基因已經(jīng)被成功地“無痕”敲除。測序結(jié)果分析也再次驗(yàn)證了此結(jié)論。敲除位點(diǎn)上只留下一個LoxP位點(diǎn)。

2.4 AP422△uvrAB的RT-PCR鑒定

對于 DNA 水平鑒定正確的菌株，利用 TRIzol提取總RNA，結(jié)果如圖3B。以uvrAB基因特異性的引物uvrAB F和uvrAB R進(jìn)行RT-PCR鑒定，結(jié)果如圖3C所示。理論上，對于uvrAB基因完全敲除株AP422△ uvrAB 來講，用引物uvrAB F和uvrAB R是擴(kuò)增不出條帶的，而對照菌株 AP422的總 RNA應(yīng)該能夠擴(kuò)增出相應(yīng)的uvrAB基因，長度為3 027 bp。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與理論值完全吻合，這也就在RNA水平上說明，uvrAB基因已經(jīng)被成功敲除，不再轉(zhuǎn)錄。

2.5 AP422△uvrAB生長曲線測定

將AP422和出發(fā)菌株AP422同時轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，每小時檢測OD600，共測定了18 h。相比較原始菌株炭疽芽胞桿菌 AP422，基因敲除后的炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB 菌株生長狀況未發(fā)生改變 (圖4)。

2.6 AP422△uvrAB菌株對PCT的敏感性測定

在相同濃度的 8-MOP (1 μg/mL) 下，AP422 △ uvrAB 相比AP422對長波紫外光更為敏感。8-MOP進(jìn)入菌株體內(nèi)和基因組結(jié)合，破壞基因組雙螺旋，在缺失uvrAB基因后，使菌株不能表達(dá)核苷酸修復(fù)酶ABC來修復(fù)DNA和RNA的損傷[5]，因此炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB 在60 min內(nèi)的光化學(xué)處理下先失去繁殖能力。而當(dāng)8-MOP濃度增高時，炭疽芽胞桿菌對紫外光敏感加強(qiáng)，當(dāng)8-MOP的濃度達(dá)到10 μg/mL時，在長波紫外燈下照射60 min，AP422全部失去繁殖能力 (圖5A)。

2.7 KBMA AP422△uvrAB代謝活性的測定

MTS (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-suLfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt)是新合成的四唑氮衍生物，它能被活細(xì)胞中線粒體脫氫酶降解而產(chǎn)生棕黃色水溶性的甲 ，能直接通過光譜吸收測定，這和炭疽芽胞桿菌的代謝活性相一致。當(dāng)與電子耦合劑PMS (Phenazine methosulfate)

圖3 完全敲除株AP422 △ uvrAB 的PCR鑒定和RT-PCR鑒定Fig. 3 Identification of B. anthracis AP422?uvrAB by PCR and RT-PCR. (A) PCR analysis of knock-out of the uvrAB gene in B. anthracis AP422. M: DNA marker; 1: AP422?uvrAB (The uvrAB gene of B. anthracis AP422 was knocked out but retained loxP site); 2: AP422 (The uvrAB gene of B.anthracis AP422 was not knocked out); 3: AP422?uvrAB::spc (The uvrAB gene of B. anthracis AP422 was knocked out but retained loxP-spc-loxP). (B) Total RNA of B. anthracis AP422 and AP422?uvrAB. M: DNA marker; 1: AP422; 2: AP422?uvrAB. (C) Identification of B. anthracis AP422 and AP422?uvrAB by RT-PCR. M: DNA marker; 1: AP422; 2: AP422?uvrAB.

圖4 炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB 與AP422菌株生長曲線的比較Fig. 4 Growth curve of B. anthracis AP422?uvrAB and AP422.

圖5 炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB 對光化學(xué)敏感性以及代謝活性檢測Fig. 5 Photochemical sensitivity and analysis of metabolic activity of B. anthracis AP422 △u vrAB. (A) Photochemical sensitivity of B. anthracis AP422?uvrAB (8-MOP: 1 μg/mL). (B) Analysis of metabolic activity of KBMA AP422△uvrAB.

聯(lián)用時，能增強(qiáng)MTS的還原反應(yīng)，提高反應(yīng)的靈敏性。PCT實(shí)驗(yàn)中，在相同的紫外照射時間 (1 h) 下，AP422△ u vrAB (8-MOP：1 μg/mL) 和AP422 (8-MOP：10 μg/mL) 都失去繁殖能力后，通過MTS試劑進(jìn)行代謝活性檢測，我們發(fā)現(xiàn)：相比 PCT AP422，AP422 △ uvrAB 和活菌一樣在4 h內(nèi)維持一個很高的代謝活性水平，即形成 KBMA AP422 △uvrAB (圖5B)。

3 討論

KBMA最早由 Brockstedt等發(fā)現(xiàn)，他們通過Amotosalen HCl (s-59) 和長波紫外光的組合方法殺死細(xì)菌[4,12-13]。本研究中，我們參照Grass等[21]的研究選擇了易于購買的8-MOP，它和s-59都是補(bǔ)骨脂素的衍生物，都具有光敏作用。本次實(shí)驗(yàn)證明，在1 μg/mL濃度的8-MOP和6 J/cm2強(qiáng)度的長波紫外光的 PCT作用下，失去繁殖能力的炭疽芽胞桿菌AP422 △ uvrAB 仍然維持代謝活性，達(dá)到了KBMA實(shí)驗(yàn)要求。

在光化學(xué)敏感實(shí)驗(yàn)中，特別要注意以下幾點(diǎn)：首先是要選擇強(qiáng)度適中的長波長紫外燈；其次是紫外照射時間不能太長；再次是菌液的用量，本次實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一都是用2 mL菌液，菌液用量太多，需要加長紫外照射時間才能殺死全部菌液，這會影響到實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；還要注意的是菌液要達(dá)到對數(shù)生長期時才能加入8-MOP，8-MOP的濃度選擇影響菌株的代謝活性檢測。

對在PCT作用下被殺死的菌液代謝活性的檢測是本次實(shí)驗(yàn)的重點(diǎn)，首先要確保實(shí)驗(yàn)用的炭疽芽胞桿菌全部在 PCT中失去繁殖能力，為了能在6 J/cm2殺死所有的菌株，所以我們選擇了對炭疽芽胞桿菌 AP422加大 8-MOP的濃度 (10 μg/mL)。8-MOP濃度太大會對菌株本身代謝活性產(chǎn)生影響，我們曾經(jīng)參照 Lin等[22]的方法用 300 μg/mL的8-MOP處理菌株，結(jié)果AP422?uvrAB在3 J/cm2的紫外光強(qiáng)度下失去了繁殖能力，但檢測出的代謝活性很低。隨后我們做了大量的摸索，最終確定了本次實(shí)驗(yàn)方案。同時，我們在實(shí)驗(yàn)中設(shè)定了兩個活菌作為對照，KBMA AP422?uvrAB和活菌一樣，在4 h內(nèi)維持了代謝活性，這也為后續(xù)的疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

相對于傳統(tǒng)的疫苗研究策略，如何采用新思路來探索更為安全和有效的新型炭疽疫苗，成為各國和政府應(yīng)對于生物突發(fā)事件的首要問題。如2009年美國猶太大學(xué)(Yeshiva University)醫(yī)學(xué)院在炭疽新型疫苗的研究中，研究人員從產(chǎn)生疫苗的毒素蛋白中尋找其中最小的蛋白質(zhì)片段(或稱多肽)，并且這個小片段的蛋白質(zhì)在注射到動物體內(nèi)后，能引起動物產(chǎn)生保護(hù)性抗體[23]。同時，KBMA的發(fā)現(xiàn)也為疫苗的研究提供了新的思路，本次實(shí)驗(yàn)的研究成果，為新型炭疽疫苗的研究提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。在當(dāng)前異常復(fù)雜國際形勢下，生物恐怖襲擊的危險依然存在，KBMA炭疽疫苗有可能會在生物反恐和保護(hù)人們的健康方面發(fā)揮積極的作用。

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