重組腺相關(guān)病毒載體相關(guān)性雜質(zhì)

刁勇，王啟釗，肖衛(wèi)東，許瑞安

華僑大學(xué)分子藥物學(xué)研究所 分子藥物教育部工程研究中心，泉州 362021

長期以來研究人員一致認為重組腺相關(guān)病毒(rAAV) 載體具有無致病性、低免疫原性等優(yōu)點，前期涉及嚙齒類及靈長類動物的大量臨床前研究也從未發(fā)現(xiàn)其會引起嚴重不良反應(yīng)[1]，但由美國賓州大學(xué)主持進行的治療血友病的rAAV基因藥物I/II期臨床研究卻發(fā)生了嚴重的細胞免疫反應(yīng)[2]，患者轉(zhuǎn)氨酶水平急劇升高，肝功能受到嚴重損害，臨床研究被迫終止。究其原因，載體衣殼蛋白 (Cap) 是引起該細胞免疫毒性的主要元兇[3-4]，載體中可以表達Cap的類AAV病毒以及空病毒顆粒等載體相關(guān)性雜質(zhì)均可能是抗原的供應(yīng)源[1]。rAAV載體相關(guān)性雜質(zhì)是指與其本身性質(zhì)非常類似的雜質(zhì)，主要包括以下3類：包裹有載體基因組之外的核酸序列的類AAV病毒顆粒；空病毒顆粒；rAAV多聚體。rAAV載體相關(guān)性雜質(zhì)的產(chǎn)生與載體的生產(chǎn)方法密切相關(guān)，因該類雜質(zhì)的理化性質(zhì)與載體本身非常類似，通過常規(guī)純化方法難以去除 (如空病毒顆粒和多聚體)，甚至幾乎不可能去除 (如包裹殘留質(zhì)?；蛩拗骷毎鸇NA的類AAV病毒顆粒)。如果該類雜質(zhì)大量出現(xiàn)在臨床應(yīng)用的制劑中則可能產(chǎn)生難以預(yù)料的不良后果：如類AAV病毒顆粒中包裝的抗生素抗性序列可能會引起病人對抗生素的耐藥性，AAV復(fù)制基因rep則具有潛在的致突變風(fēng)險，rAAV多聚體的形成則會嚴重降低產(chǎn)品的穩(wěn)定性，增加衣殼抗原的免疫原性。如何減少rAAV載體相關(guān)雜質(zhì)的污染，防止rAAV載體相關(guān)雜質(zhì)的形成，是當(dāng)前建立 rAAV載體生產(chǎn)工藝最重要的任務(wù)之一。

1 類AAV病毒顆粒

在生產(chǎn) rAAV載體的過程中，轉(zhuǎn)染用質(zhì)粒或宿主細胞DNA會被誤包裝而形成類AAV病毒顆粒。類AAV病毒顆粒又可分為可復(fù)制型 (rcAAV) 和復(fù)制缺陷型兩類。曾有報道在 17批不同血清型的rAAV產(chǎn)品中，可表達cap基因的rcAAV污染率可達0.4%~1.0%，如采用非優(yōu)化工藝進行生產(chǎn)污染率則可高達 10%[5]。體內(nèi)應(yīng)用 rAAV載體后可在多種組織內(nèi)檢出污染的雜質(zhì)DNA序列，部分DNA序列與 AAV的反向末端重復(fù) (ITR) 相連接存在，并在一定條件下可以釋出并具有復(fù)制活性[6]。近期動物實驗表明，cap基因在體內(nèi)的表達會引起嚴重的免疫反應(yīng)[7-8]，而包裝有其他DNA雜質(zhì)的rcAAV則具有致瘤性或引入抗生素抗性的潛在風(fēng)險[6]。

因類AAV病毒顆粒與真正的AAV病毒幾乎完全一樣，一旦形成則難以去除，必須從包裝工藝入手防止或減少其產(chǎn)生。AAV基因組含有兩個開放閱讀框架，分別編碼調(diào)節(jié)基因 (rep) 和結(jié)構(gòu)基因(cap)，兩端為145 bp的ITR。ITR是病毒復(fù)制和包裝必須的順式作用元件。三質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染法是生產(chǎn)rAAV載體最常用的方法，所用的 3個質(zhì)粒分別為rAAV載體質(zhì)粒 (p-vecter)、AAV輔助質(zhì)粒 (p-AAV)和Ad病毒輔助質(zhì)粒 (p-Ad)。在 p-vecter內(nèi)，AAV基因組的rep–cap基因被轉(zhuǎn)基因表達框所替代。Rep和Cap蛋白由p-AAV反式提供。p-Ad則替代了最初研究所應(yīng)用的腺病毒，負責(zé)提供包裝 rAAV所必須的輔助病毒的相應(yīng)功能。

類AAV病毒顆粒的形成主要是由于rAAV載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒間的非同源重組而引起，載體質(zhì)粒中含有的ITR在重組事件中發(fā)揮了重要作用[6]。ITR是AAV復(fù)制、包裝所必需的最少自身序列，序列中CG 含量達80%以上，其前125 bp (1~125) 序列依次可分為A、B、B’、C’、C和A’等不同的區(qū)段，其中A與A’、B與B’、C與C’反向互補可形成T形發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作為AAV基因組自我復(fù)制的起點。ITR末端20 bp大小的D序列是唯一的非回文序列，具有 Rep蛋白結(jié)合位點 (RBS) 和末端解鏈位點(TRS)，對AAV的復(fù)制和包裝非常重要，TRS和包裝信號均處于D序列中。基因組中含有一個ITR及兩個D序列即可以滿足AAV基因組的復(fù)制和包裝需要。在缺失D序列時，ITR形成的發(fā)夾結(jié)構(gòu)不足以包裝基因組。Wang等將載體質(zhì)粒中ITR的D序列遠端的10個核苷酸缺失后，發(fā)現(xiàn)可以抑制載體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒之間的非同源重組，產(chǎn)品中rcAAV的含量因此大大降低[9]。

Nony等[10]發(fā)現(xiàn)位于rep基因5′端的順式復(fù)制元件 (CARE) 具有Rep依賴性復(fù)制活性，在無ITR序列存在的條件下，輔助質(zhì)粒中的rep-cap基因也可以被包裝形成復(fù)制缺陷型類AAV病毒顆粒。將CARE缺失后，則未檢出包裝有rep-cap基因的類AAV病毒顆粒。質(zhì)粒的復(fù)制能力對其被包裝的可能性也有很大影響[6]。與含有 ITR的載體質(zhì)粒比較，幾乎缺失了p5啟動子全部序列的輔助質(zhì)粒pDG被包裝的幾率要小。Allen等以異源性啟動子替代輔助質(zhì)粒中使用的p5和p40啟動子；將rep和cap基因分為兩個獨立的轉(zhuǎn)錄單元，且轉(zhuǎn)錄方向相反，有效地降低了rep和cap基因被重組包裝為rcAAV的可能性[11]。

AAV對基因組的大小有嚴格限制，如超過4.7 kb就很難包裝為病毒顆粒。本課題組在輔助質(zhì)粒的rep和cap表達框內(nèi)插入某些特定的內(nèi)含子，使得輔助質(zhì)?；蚪M的大小遠遠超出了 AAV的包裝容量而不被誤包裝，rcAAV的污染可以降低2~3個數(shù)量級[12]。Hauck等使用類似的策略，也成功地降低了rAAV2和rAAV6載體中類病毒顆粒的污染[13]。

基于ITR在野生型AAV生長過程中發(fā)揮的重要作用，我們將包裝缺陷型ITR引入輔助質(zhì)粒，希望輔助質(zhì)粒如同野生型AAV一樣對rep和cap基因的表達發(fā)揮順式時空調(diào)控作用，從而提高 rAAV的生產(chǎn)效率[14]。在輔助質(zhì)粒內(nèi)插入一定的異源性內(nèi)含子，使其體積大大超過 AAV的包裝容量而不被包裝為類AAV病毒顆粒；另外因所用的ITR缺失了D序列中的包裝調(diào)控序列，有利于減少rcAAV的產(chǎn)生。結(jié)果該方法既將rAAV的包裝效率提高了20倍，又有效地降低了rcAAV的產(chǎn)生。

2 空病毒顆粒

AAV空病毒顆粒是不含任何DNA的假病毒，僅由3種不同的衣殼蛋白VP1、VP2和VP3 組成，構(gòu)成定量比與真AAV一樣為1∶1∶10。空病毒顆粒的自組裝與載體 DNA的復(fù)制和包裝無關(guān)。在 Rep蛋白的參與下，組裝好的空病毒顆粒向核質(zhì)遷移，載體 DNA的包裝發(fā)生在已組裝完畢的空病毒顆粒遷移至核質(zhì)后。野生型AAV的包裝效率雖然明顯高于 rAAV，但也會產(chǎn)生 50%以上的空病毒顆粒，而制備rAAV載體時應(yīng)用的rep基因序列往往缺失了部分順式元件 (如p5啟動子和CARE元件)，所以包裝效率顯著降低，空殼率更高。由于 rAAV載體衣殼與AAV空病毒顆粒的構(gòu)成完全一致，采用實驗室常規(guī)的親和層析方法根本不能將二者有效分離。

大量探討 rAAV載體引起嚴重的肝細胞免疫毒性原因的后續(xù)研究表明，該細胞免疫反應(yīng)由 rAAV載體衣殼蛋白所引起，載體衣殼蛋白抗原通過經(jīng)典或非經(jīng)典抗原遞呈途徑被遞呈至病人肝細胞表面，然后激活記憶性T細胞引起免疫反應(yīng)[3]。rAAV載體的細胞免疫反應(yīng)與抗原輸入量呈量效關(guān)系。空病毒顆粒內(nèi)不含轉(zhuǎn)基因組，不僅沒有任何療效，反而會增加抗原輸入量[1,15]。另外，空病毒顆粒的存在還會降低 rAAV載體的溶解度，促進其凝聚，影響其儲存穩(wěn)定性[16]。

通過分析比較空病毒顆粒與 rAAV載體性質(zhì)的差異，可以對常用 rAAV載體生產(chǎn)工藝進行優(yōu)化，建立有效減少終產(chǎn)品中空病毒顆粒含量的純化方法，從而提高藥物比活性，降低臨床用藥劑量，降低病人體內(nèi)衣殼蛋白抗原負荷，提高產(chǎn)品穩(wěn)定性。

基于空病毒顆粒與rAAV載體浮力密度的差異，可以通過密度梯度離心法進行分離。在氯化銫(CsCl) 密度梯度離心后，野生型 AAV出現(xiàn)在密度1.41 g/mL處，rAAV載體因為轉(zhuǎn)基因表達框大小不同而稍有差異?？詹《绢w粒因不含基因組而出現(xiàn)在較低的密度區(qū)間 (約 1.32 g/mL)，可以很容易與rAAV載體分離，成為CsCl密度梯度離心最突出的優(yōu)點。但由于rAAV載體與核酸及蛋白雜質(zhì)間存在非特異性結(jié)合，三者的數(shù)量比也不均衡，往往需要2次、甚至3次CsCl梯度離心才得到高純度rAAV載體。但rAAV載體長時間與高濃度CsCl接觸，會導(dǎo)致滴度降低。Auricchio首先詳細研究了 CsCl對 rAAV載體的破壞作用，他們將 rAAV載體與CsCl孵育24 h后，rAAV載體感染滴度降低2倍[17]。在72 h后，相當(dāng)于2次CsCl梯度離心，rAAV載體感染滴度僅存13%。碘克沙醇是一種長期臨床應(yīng)用的X線造影劑，可以替代CsCl有效去除空病毒

顆粒[18-19]。

密度梯度離心的優(yōu)點是適用于所有血清型rAAV的純化。缺點主要是僅經(jīng)密度梯度離心得到的產(chǎn)品，純度尚達不到臨床應(yīng)用標準，另外處理量小、不易放大生產(chǎn)規(guī)模也限制了其應(yīng)用。最近研究認為，適當(dāng)增加前處理，可以縮小樣品體積，有利于密度梯度離心方法的工業(yè)化應(yīng)用。Ayuso等[20]在CsCl梯度離心工藝前，增加PEG沉淀步驟，產(chǎn)品的純度明顯提高，雖然也需要2次CsCl梯度離心，但體內(nèi)外效價無明顯降低。Lock等[19]則常用切向流過濾(TFF) 技術(shù)，對密度梯度離心前樣品進行濃縮。他們用截留分子量為 100 kDa的 TFF膜將樣品濃縮130倍，為之后的密度梯度離心提供了方便。濃縮樣品經(jīng)碘克沙醇密度梯度離心得到的 rAAV8、rAAV9載體產(chǎn)品中，空白病毒顆粒含量為0.4%~5%，回收率為26%左右[19]。

空病毒顆粒包裝載體基因組后其構(gòu)型可能發(fā)生改變，導(dǎo)致衣殼蛋白VP1和VP2的N-端酸性氨基酸殘基從病毒顆粒五重對稱軸的孔中穿出；載體基因組的包裝導(dǎo)致病毒整體陰離子電荷增加，兩種因素均導(dǎo)致 rAAV載體的等電點較空病毒顆粒有所降低[21]。因此可以通過離子交換色譜法將空病毒顆粒與載體分離[21-22]。

Urabe等[23]采用陰離子交換色譜成功地將空病毒顆粒與 rAAV1載體分離。以反離液離子(Antichaotropic ion)，如 NH4+、(CH3)4N+、PO43?和SO42?等代替 NaCl進行鹽濃度梯度洗脫，分離效果明顯增加，特別是 [(CH3)4N]2SO4和硫酸三甲基胺最佳。上樣溶液的 pH對分離效果也有顯著影響，高pH值9和8.5的效果優(yōu)于8.0和7.5。經(jīng)過1次高分辨柱陰離子交換色譜分離后，大約90%的空病毒顆粒被去除。第2次高分辨柱純化后得到的rAAV1載體樣品中空病毒顆粒含量少于 5%，回收率均高于50%。純化后樣品生物滴度顯著增加，小鼠肌肉注射rAAV1載體后第56天，血清轉(zhuǎn)基因表達較未去除空病毒顆粒的樣品增加10倍左右[23]。Qu等[21]采用陽離子和陰離子交換二步色譜法，得到的終產(chǎn)品中空病毒顆粒含量小于1%，總體收率為74%。該工藝不僅適用于血清型 rAAV2載體，也可以用于rAAV6載體的純化。

膜色譜是將液相色譜與膜分離融合于一起的新型生化分離技術(shù)，具有選擇性高、分離速度快、能耗低、易放大等特點，是分離純化生化大分子藥物的有力工具。與液相色譜比較，膜色譜擴散路徑短、傳質(zhì)快、分離時間短、分離效率顯著提高、易于放大、便于實現(xiàn)大規(guī)模連續(xù)分離和自動操作。與膜技術(shù)相比，膜色譜不僅是利用膜孔徑的大小，更主要的是利用其特異性和選擇性，只要選擇合適的膜就可以從復(fù)雜體系，尤其是細胞培養(yǎng)液中分離和制取出任何一種生物大分子。近年來該技術(shù)被用于rAAV載體的純化，可有效去除空病毒顆粒雜質(zhì)[22]。將rAAV載體收獲液上樣至陽離子交換膜后，空病毒顆粒因等電點高呈現(xiàn)較強的正電性，絕大部分 (97%)被吸附至陽離子交換膜，而 rAAV載體則直接穿透通過。然后將穿透液上樣至陰離子交換膜，經(jīng)NaCl濃度線性洗脫后，空病毒顆粒含量降低至1%以下。

3 rAAV多聚體

在 rAAV載體的純化和儲存過程中，如實驗條件選擇不當(dāng)，往往會促使 rAAV載體聚集形成多聚體，從而影響純化收率，降低產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

AAV在常用緩沖液 (如磷酸鹽緩沖液和Tris緩沖液) 中的溶解度較低，當(dāng)濃度達到2×1013VP/mL時，就會出現(xiàn)一定程度的聚集現(xiàn)象。濃度為25%的甘油溶液可以增加其溶解度至1.8×1015VP/mL[24]，但甘油含量如低于 5%則無明顯作用。中性表面活性劑辛基-吡喃葡萄糖苷 (0.01%~0.5%) 可緩解AAV的聚集，降低溶液pH則有利于提高溶解度。在加入 0.5%辛基-吡喃葡萄糖苷的條件下，濃度為2×1013VP/mL的樣品在pH 4.5時完全溶解，升高至5.7則出現(xiàn)聚集[24]。

一般認為溶液中二價陽離子較一價陽離子能更好地抑制病毒的聚集[24-25]，但Wright等[26]的研究表明，rAAV載體溶液的離子強度是影響其聚集的重要因素，無論采用的離子種類如何，只要增加離子強度至 200 mmol/L就可以抑制 rAAV的聚集。Wright等[26]曾推測rAAV的聚集可能是由于相鄰病毒粒子間帶電氨基酸殘基的相互作用引起，所以嘗試以游離支鏈氨基酸阻止聚集的發(fā)生。但氨基酸的加入對 rAAV的聚集并沒有特殊的作用，仍然需要達到200 mmol/L的離子強度才有效果。

凍融循環(huán)是 rAAV載體制備工藝中裂解細胞常用的手段，也是引起病毒聚集的因素之一。在150 mmol/L的磷酸鈉緩沖液中rAAV在4 ℃保存5 d未見聚集，但一次凍融 (4 ℃~?20 ℃) 就導(dǎo)致明顯的聚集[26]。在10 mmol/L磷酸鈉緩沖液 (pH 7.4) 保存的rAAV經(jīng)過4 ℃至?80 ℃的一次凍融循環(huán)，滴度降低3倍以上[27]。

在 rAAV載體生產(chǎn)工藝中，雖然都含有降解核酸的步驟，但裂解液的鹽離子種類和濃度并不是核酶 (一般為Benzonase) 的最佳反應(yīng)條件，所以rAAV載體表面仍殘留痕量核酸雜質(zhì)。對純化后樣品再次進行核酶處理后，即使在低離子強度條件也未見聚集現(xiàn)象，而未處理的樣品則需要高離子強度 (大于200 mmol/L) 才能抑制聚集現(xiàn)象[26]。這說明載體表面的核酸雜質(zhì)可以通過離子鍵與相鄰病毒粒子結(jié)合形成多聚體。細胞裂解液中一價陽離子的存在會降低核酶的活性，造成DNA降解不充分，以二價陽離子 (如 Mg2+) 鹽代替鈉鹽則有利于提高核酶處理的效果，核酶處理30 min后再調(diào)節(jié)離子強度至0.15 mol/L，rAAV的收率提高4倍[25]。Qu等[21]在用離子交換色譜去除空病毒顆粒的工藝中，在陽離子交換色譜柱上進行原位核酶消化處理，結(jié)果既有效地避免了 rAAV載體的聚集，又提高了與空病毒顆粒的分離度。

4 結(jié)論

安全、穩(wěn)定、有效是對所有藥品最基本的三大要求，基因治療藥物更需要把安全性指標放在首位。雖然近年來應(yīng)用rAAV載體在治療Leber’s先天性黑內(nèi)障方面取得重大突破[28-29]，因此被Science雜志評為2009年十大科學(xué)進展之一[30]，但rAAV載體在臨床研究中出現(xiàn)的細胞免疫毒性[2]，時刻提醒人們必須對其安全性給予高度關(guān)注。

rcAAV是類AAV病毒顆粒中危害最大的載體相關(guān)性雜質(zhì)，一旦轉(zhuǎn)染人體細胞便可以源源不斷地產(chǎn)生異源蛋白，造成意想不到的不良反應(yīng)。因這類雜質(zhì)與 rAAV載體的性質(zhì)如出一轍，目前尚無下游純化技術(shù)可以去除，必須從上游工藝技術(shù)著手加以限制，如對生產(chǎn)用各種質(zhì)粒的表達元件進行優(yōu)化，防止同源或非同源重組，防止非載體基因組的病毒包裝。因痕量rcAAV即可造成大危害，本課題組將特異性 microRNA結(jié)合序列引入 rAAV輔助質(zhì)粒rep-cap基因的3′ UTR區(qū)域，以便在即使存在rcAAV污染的情況下，也可以控制rcAAV在靶細胞內(nèi)的異源蛋白表達[31]。

空病毒顆粒是在 rAAV載體包裝前產(chǎn)生，但可以通過下游技術(shù)去除的一類雜質(zhì)。雖然其與 rAAV載體外殼一致，但二者浮力密度的差異足以采用密度梯度離心加以分離。近期開發(fā)的離子交換色譜方法更為規(guī)?；a(chǎn)提供了技術(shù)手段。然而，二者理化性質(zhì)的近似性仍然對分離條件的參數(shù)控制提出了嚴格要求。

rAAV多聚體是在下游處理及儲存過程中出現(xiàn)的一類雜質(zhì)，離子強度、pH、溫度等實驗參數(shù)的非優(yōu)化選擇均可能導(dǎo)致 rAAV載體的聚集，而這些參數(shù)的優(yōu)化和控制也正是在實際操作中容易被忽視或難以持續(xù)被關(guān)注的常見問題。

隨著 rAAV載體本身的不斷更新和優(yōu)化[32]、細胞包裝技術(shù)的不斷成熟[33]，下游生產(chǎn)純化技術(shù)的同步發(fā)展也一定會極大地促進其在臨床上更廣泛地應(yīng)用，加速其產(chǎn)業(yè)化進程。

[1] Diao Y, Wang QZ, Xiao WD, et al. Cellular immunotoxicity of rAAV gene medicine and possible solutions. Acta Pharm Sin, 2010, 45(9): 1071?1077.刁勇, 王啟釗, 肖衛(wèi)東, 等. 重組腺相關(guān)病毒基因藥物的細胞免疫毒性及對策. 藥學(xué)學(xué)報, 2010, 45(9): 1071?1077.

[2] Manno CS, Pierce GF, Arruda VR, et al. Successful transduction of liver in hemophilia by AAV-factor IX and limitations imposed by the host immune response. Nat Med, 2006, 12(3): 342?347.

[3] Mingozzi F, Maus MV, Hui DJ, et al. CD8+T-cell responses to adeno-associated virus capsid in humans. Nat Med, 2007, 13(4): 419?422.

[4] Madsen D, Cantwell ER, O’Brien T, et al. Adeno-associated virus serotype 2 induces cell-mediated immune responses directed against multiple epitopes of the capsid protein VP1. J Gen Virol, 2009, 90(11): 2622?2633.

[5] Wright JF. Transient transfection methods for clinical adeno-associated viral vector production. Hum Gene Ther, 2009, 20(7): 698?706.

[6] Chadeuf G, Ciron C, Moullier P, et al. Evidence for encapsidation of prokaryotic sequences during recombinant adeno-associated virus production and their in vivo persistence after vector delivery. Mol Ther, 2005, 12(4): 744?753.

[7] Li CW, Hirch M, Asokan A, et al. Adeno-associated virus type 2 (AAV2) capsid-specific cytotoxic T lymphocytes eliminate only vector transduced cells coexpressing the AAV2 capsid in vivo. J Virol, 2007, 81(14): 7540?7547. [8] Wang LL, Figueredo J, Calcedo R, et al. Cross-presentation of adeno-associated virus serotype 2 capsids activates cytotoxic T-cells but does not render hepatocytes effective cytolytic targets. Hum Gene Ther, 2007, 18(3): 185?194.

[9] Wang XS, Khuntirat B, Qing K, et al. Characterization of wild-type adeno-associated virus type 2-like particles generated during recombinant viral vector production and strategies for their elimination. J Virol, 1998, 72(7): 5472?5480.

[10] Nony P, Chadeuf G, Tessier J, et al. Evidence for packaging of rep-cap sequences into adeno-associated virus (AAV) type 2 capsids in the absence of inverted terminal repeats: a model for generation of rep-positive AAV particles. J Virol, 2003, 77(1): 776?781.

[11] Allen JM, Debelak DJ, Reynolds TC, et al. Identification and elimination of replication-competent adeno-associated virus (AAV) that can arise by nonhomologous recombination during AAV vector production. J Virol, 1997, 71(9): 6816?6822.

[12] Cao L, Liu YH, During MJ, et al. High-titer, wild-type free recombinant adeno-associated virus vector production using intron-containing helper plasmids. J Virol, 2000, 74(24): 11456?11463.

[13] Hauck B, Murphy SL, Smith PH, et al. Undetectable transcription of cap in a clinical AAV vector: implications for preformed capsid in immune responses. Mol Ther, 2009, 17(1): 144?152.

[14] Cao L, During M, Xiao W. Replication competent helper functions for recombinant AAV vector generation. Gene Ther, 2002, 9(18): 1199?1206.

[15] Mingozzi F, High KA. Immune responses to AAV in clinical trials. Curr Gene Ther, 2007, 7(5): 316?324.

[16] Wright JF. Manufacturing and characterizing AAV-based vectors for use in clinical studies. Gene Ther, 2008, 15(11): 840?848.

[17] Auricchio A, Hildinger M, O'Connor E, et al. Isolation of highly infectious and pure adeno-associated virus type 2 vectors with a single-step gravity-flow column. Hum Gene Ther, 2001, 12(1): 71?76.

[18] Brument N, Morenweiser R, Blouin V, et al. A versatile and scalable two-step ion-exchange chromatography process for the purification of recombinant adeno-associated virus serotypes-2 and -5. Mol Ther, 2002, 6(5): 678?686.

[19] Lock M, Alvira M, Vandenberghe LH, et al. Rapid, simple, and versatile manufacturing of recombinant adeno-associated viral vectors at scale. Hum Gene Ther, 2010, 21(10): 1259?1271.

[20] Ayuso E, Mingozzi F, Montane J, et al. High AAV vector purity results in serotype- and tissue-independent enhancement of transduction efficiency. Gene Ther, 2010, 17(4): 503?510.

[21] Qu G, Bahr-Davidson J, Prado J, et al. Separation of adeno-associated virus type 2 empty particles from genome-containing vector by anion-exchange column chromatography. J Virol Methods, 2007, 140(1/2): 183?192.

[22] Okada T, Nonaka-Sarukawa M, Uchibori R, et al. Scalable purification of adeno-associated virus serotype 1 (AAV1) and AAV8 vectors, using dual ion-exchange adsorptive membranes. Hum Gene Ther, 2009, 20(9): 1013?1021.

[23] Urabe M, Xin KQ, Obara Y, et al. Removal of empty capsids from type 1 adeno-associated virus vector stocks by anion-exchange chromatography potentiates transgene expression. Mol Ther, 2006, 13(4): 823?828.

[24] Xie Q, Hare J, Turnigan J, et al. Large-scale production, purification and crystallization of wild-type adeno-associated virus-2. J Virol Methods, 2004, 122(1): 17?27.

[25] Chahal PS, Aucoin MG, Kamen A. Primary recovery and chromatographic purification of adeno-associated virus type 2 produced by baculovirus/insect cell system. J Virol Methods, 2007, 139(1): 61?70.

[26] Wright JF, Le T, Prado J, et al. Identification of factors that contribute to recombinant AAV2 particle aggregation and methods to prevent its occurrence during vector purification and formulation. Mol Ther, 2005, 12(1): 171?178.

[27] Croyle MA, Cheng X, Wilson JM. Development of formulations that enhance physical stability of viral vectors for gene therapy. Gene Ther, 2001, 8(17): 1281?1290.

[28] Bainbridge JWB, Ophth FRC, Smith AJ, et al. Effect of gene therapy on visual function in Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med, 2008, 358(21): 2231?2239.

[29] Maguire AM, Simonelli F, Pierce EA, et al. Safety and efficacy of gene transfer for Leber's congenital amaurosis. N Engl J Med, 2008, 358(21): 2240?2248.

[30] Alberts B. The Breakthroughs of 2009. Science, 2009, 326(5960): 1589.

[31] Xu RA, Xiao WD, Lu H. A HAAVmir gene containing a novel cell specific microRNA binding domain used for gene therapy: CN, 200910136134.5. 2009-09-16.

[32] Lü Y, Wang Q, Xiao WD, et al. Trends in development of self-complementary adeno-associated virus vector. Chin J Biotech, 2009, 25(5): 658?664.呂穎慧, 王啟釗, 肖衛(wèi)東, 等. 自身互補型腺相關(guān)病毒載體發(fā)展趨勢. 生物工程學(xué)報, 2009, 25(5): 658?664.

[33] Wang F, Diao Y, Xiao WD, et al. Large-scale production of recombinant adeno-associated virus (rAAV). Chin J Biotech, 2009, 25(11): 1608?1613.王峰, 刁勇, 肖衛(wèi)東, 等. 重組腺相關(guān)病毒規(guī)?；锇b技術(shù). 生物工程學(xué)報, 2009, 25(11): 1608?1613.