牛非結(jié)核分枝桿菌分離與鑒定

王鐵峰,張 宇,錢愛東

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,吉林長春 130118)

非結(jié)核分枝桿菌(Nontuberculousmycobacterium,NTM)廣泛存在于環(huán)境中,它能夠引發(fā)類結(jié)核樣病變,為結(jié)核病的及時防治帶來一定的困難[1]。同時,由于其種類多、耐藥性多變的特點,也造成了對其鑒別防治的困難。由于國內(nèi)外沒有非結(jié)核分枝桿菌鑒別分類的標(biāo)準(zhǔn)操作程序,所以目前對非結(jié)核的流行情況調(diào)查及分離鑒定數(shù)據(jù)非常少,使得NTM的科研工作缺少了一定的理論數(shù)據(jù),本試驗對吉林省內(nèi)牛NTM的流行情況做了調(diào)查,分別采用了生物化學(xué)、分子生物學(xué)、實驗室常規(guī)染色等方法進行了細(xì)菌的分離鑒定工作,最終得到吉林省境內(nèi)近年來牛NTM的新的流行情況。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株和待檢樣品 試驗所用標(biāo)準(zhǔn)菌株偶發(fā)分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌、戈氏分枝桿菌、瘰癘分枝桿菌、蟾蜍分枝桿菌均購于中國科學(xué)院微生物研究所。鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌和副結(jié)核分枝桿菌為吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)微生物教研室保存的國際標(biāo)準(zhǔn)株。

待檢樣品:試驗中從吉林省長春市、德惠市、雙陽市、九臺市、白城市、四平市、通化市等多個地區(qū)采集牛的頜下淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)作為待檢樣品。1.2 分離培養(yǎng)基 本試驗采用改良羅杰氏培養(yǎng)基(L-J)進行NTM的分離與擴增培養(yǎng)。培養(yǎng)基按照《病原細(xì)菌檢驗技術(shù)》中的方法配制。

1.3 各種主要試劑 檸檬酸鐵銨、亞碲酸鉀、α-荼胺、吐溫-80等生化試劑均購自北京化工廠;酚酞二硫酸三鉀購自比利時ACROS化學(xué)公司;限制性內(nèi)切酶BstEⅡ、HaeⅢ均購自 Fermeatas公司;引物Tb11和Tb12均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成;Taq酶等分子生物學(xué)試劑均購自天根試劑有限公司;其他無機化學(xué)試劑均為分析純試劑,購自北京化學(xué)試劑有限公司。

1.4 細(xì)菌分離培養(yǎng) 采用酸處理法處理被檢樣品,用十字勻漿器研磨成漿液狀,接種于L-J斜面上,37℃培養(yǎng),每3 d觀察1次,對每一個生長出的菌落做好標(biāo)記,挑取少量菌體做抗酸染色,并根據(jù)菌體形態(tài)進行初步鑒定?？顾崛旧幮曰?周后仍未生長者為陰性。

1.5 細(xì)菌鑒定

1.5.1 生物學(xué)與生物化學(xué)方法鑒定 生長特性試驗:將分離菌接種于 L-J上,分別置于28℃、37℃、45℃條件下培養(yǎng),定期觀察記錄生長情況。菌體產(chǎn)色試驗:將分離菌設(shè)避光與不避光兩組進行細(xì)菌產(chǎn)色培養(yǎng)試驗。培養(yǎng)基生長試驗:將分離菌分別接種于PNB培養(yǎng)基、TCH 培養(yǎng)基、5%NaCl培養(yǎng)基、苦味酸培養(yǎng)基、谷氨酸鈉葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上,觀察其生長情況。生化試驗:將分離菌分別采用耐熱觸酶、硝酸鹽還原、吐溫-80水解、尿素酶、芳香硫酸酯酶、鐵離子吸收、亞碲酸鹽還原等試驗檢測其生化特性。

1.5.2 分子生物學(xué)方法鑒定 采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性分析方法對分離菌株進行檢測。合成通用引物 Tb11:5′-ACCAACGATGGTGTGTCCA T-3′和 Tb12:5′-CTTGTCGAACCGCATACCCT-3′,對 NTM的保守序列 hsp65進行擴增,反應(yīng)條件為:94℃5m in預(yù)變性,94℃1min變性,60℃1min退火,72℃1min延伸,共30個循環(huán)后72℃10m in延伸,均擴增出長度439bp的目的片段。反應(yīng)完成后將擴增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶BstEⅡ和 HaeⅢ進行酶切,2%瓊脂糖凝膠電泳檢測,根據(jù)所得片段確定各分枝桿菌特征性的酶切圖譜,從而對分枝桿菌進行鑒別。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果 試驗共計檢測樣品1000份,其中長春市250份(頜下淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)各125份)、德惠市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)、雙陽市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)、九臺市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)、白城市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)、四平市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)、通化市125份(頜下淋巴結(jié)63份與腸系膜淋巴結(jié)62份)。8周內(nèi)可見菌經(jīng)抗酸染色為陽性的樣品共計25份,NTM陽性培養(yǎng)率為2.5%,成功分離擴增共計14株NTM。

2.2 細(xì)菌鑒定結(jié)果 經(jīng)生物學(xué)與生物化學(xué)方法和分子生物學(xué)方法鑒定分類成功分離的菌株中,母牛分枝桿菌1株,龜分枝桿菌膿腫亞種2株,蘇加分枝桿菌2株,偶發(fā)分枝桿菌1株,蟾蜍分枝桿菌6株,胞內(nèi)分枝桿菌2株。其中,頜下淋巴結(jié)NMT陽性樣品為8份,陽性率為1.59%,成功分離出7株,分別是蘇加分枝桿菌1株,龜分枝桿菌膿腫亞種2株,蟾蜍分枝桿菌1株,牛分枝桿菌1株,胞內(nèi)分枝桿菌2株;在腸系膜淋巴結(jié)培養(yǎng)物中生長出陽性菌株的樣品有17份,陽性率為3.42%,成功分離出7株,其中蘇加分枝桿菌1株,偶發(fā)分枝桿菌1株,蟾蜍分枝桿菌5株。分離情況見表1、表2。

表1 NTM牛群中檢出率

表2 NTM分離擴增的情況 (株)

3 討論

試驗結(jié)果,從1 000份牛頜下淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)中共檢出陽性帶菌樣品25份,牛群中總檢出率為2.5%,低于1998年王振國等人3%的調(diào)查結(jié)果[2],分析:主要有兩方面的原因,一個可能是由于飼養(yǎng)管理條件的改善,有試驗表明,環(huán)境中水源、土壤、飼料、墊料、工作用具等都能夠攜帶并傳播NTM[1],這給該菌的防治帶來了極大的困難,所以飼養(yǎng)管理條件的加強,對降低該菌的傳播與感染具有一定作用;另一個原因可能是試驗中所檢樣品,均采集自經(jīng)過牛結(jié)核(副結(jié)核)變態(tài)反應(yīng)檢查呈陰性的牛體,減少了結(jié)核與非結(jié)核分枝桿菌混合感染的對象,也可能成為檢出率降低的原因之一。但2.5%的檢出率仍然說明NTM單獨感染的情況不容樂觀,尤其是在目前畜牧業(yè)生產(chǎn)過程中并沒有專門針對NTM檢疫的情況下,NTM的攜帶與感染給畜牧生產(chǎn)乃至畜牧產(chǎn)品消費者的健康帶來隱形的危害。NTM往往不引起典型的癥狀,所以由其帶來的負(fù)面影響往往不能夠引起畜牧生產(chǎn)者的足夠認(rèn)知,但隨著生物的進化,一旦該菌的感染情況明顯化,且?guī)淼奈：Ρ徽_評估,而由于我們的疏于防治,就會滯后對該菌的預(yù)防。

試驗結(jié)果顯示,頜下淋巴結(jié)的檢出率為1.59%,低于腸系膜淋巴結(jié)的檢出率3.42%,這與錢愛東1988年在豬體內(nèi)NTM分離情況[3]不同,分析原因:(1)牛的消化方式與豬不同,所以其消化道內(nèi)微生態(tài)環(huán)境的不同可能成為其腸系膜淋巴結(jié)NTM感染率大于頜下淋巴結(jié)的原因之一。(2)飼料情況不同,豬群大都飼喂經(jīng)過深加工過的飼料,而牛等反芻動物大都飼喂經(jīng)過簡單加工的生草、秸桿等,飼料中的非結(jié)核分枝桿菌存活率高,造成牛等反芻動物直接攝取分枝桿菌進入消化道的機率增高。(3)飼養(yǎng)環(huán)境差異,豬群無論是集約化養(yǎng)殖還是小規(guī)模養(yǎng)殖往往采用圈養(yǎng)的方式較多,活動范圍較小,減少了與外界環(huán)境中NTM接觸的機會,而試驗中所調(diào)查的牛是主要來自各個地區(qū)個體飼養(yǎng)者送屠宰場宰殺的牛只,其散養(yǎng)者居多,活動范圍廣,與環(huán)境中NTM的接觸機率高,這可能是造成豬、牛非結(jié)核分枝桿菌感染情況的差異之一。從牛頜下淋巴結(jié)與腸系膜淋巴結(jié)NTM分離率不一,同時與以往豬群中該菌調(diào)查情況的差別看來,在對NTM的防治方面,不應(yīng)僅僅局限于臨床診斷、藥物防治,還應(yīng)該從環(huán)境微生態(tài)學(xué)及不同動物生理習(xí)慣角度加以研究,這樣既能減少醫(yī)學(xué)用藥對動物機體的損傷,又能節(jié)約成本開支,有利于營造良好的生態(tài)環(huán)境,不僅僅對NTM的防治,對其他制約動物生產(chǎn)生活條件改善的不利因素都能有積極的作用。

目前,對于NTM能夠引起人類疾病的報道越來越多,NTM所能引起的疾病并不局限于呼吸系統(tǒng)[4-5],本試驗中所分離到的多種分枝桿菌都有對人致病的報道[6-8],且種類數(shù)據(jù)與國內(nèi)外報道的病例基本相符[9-10],帶菌牛所產(chǎn)的畜牧產(chǎn)品如肉、奶等經(jīng)過消費、運輸環(huán)節(jié)可能到達(dá)廣大消費者手中,使消費者及動物性消費者接觸甚至感染該菌,而NTM一旦發(fā)病,所采用的治療藥物不同于抗結(jié)核藥物,需要鑒別診斷后用藥才能達(dá)到理想的治療效果,由此引起的危害很大,所以加強對NTM的檢驗,尤其是致病性NTM的檢驗是十分必要的,同時也應(yīng)該注意動物與人之間通過直接或間接接觸而導(dǎo)致該菌相互傳播的預(yù)防。

[1] 楊建華,馬麗萍.非結(jié)核分枝桿菌感染現(xiàn)狀和治療的探討[J].醫(yī)藥論壇雜志,2004,25(17):3-4.

[2] 王振國,羅雁飛,床廣文.牛源非典型分枝桿菌的分離與鑒定[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1998,20(2):73-77.

[3] 錢愛東,陳獎勵.豬源MA IC菌分離及其血清型的研究[J].吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,1988,10(3):79-84.

[4] Rajesh K,Wayne Halfpenny JK.Rare presentation of Mycobacterium avium-intracellulare infection[J].British Journal of Oral and Maxillofacial Surgery,2007,45:670-672.

[5] Susan T,Thom as F.The rapidly grow ing mycobacteria:sap rophytes and parasites[J].Microbesand In fection,2000,2:1845?1853.

[6] Brow n B A,Sp ringer B,Steingrube V A,eta l.A cooperative study from the InternationalWorking G roup on Mycobacterial Taxonomy[J].Sy st Bacteriol,1999,49:1493-1511.

[7] Wallace R J,Musser JM,HullS I,eta l.Diversity and sou rces of rapidly growingmycobacteria associated w ith infections following cardiac su rgery[J].Infect Dis,1989,159:708-716.

[8] Shojaei H,Goodfellow M,Magee JG,etal.Mycobacterium novocastrense sp nov a rapidly growing photoch romogenic Mycobacterium[J].Syst Bacteriol,1997,47:1205-1207.

[9] Sven Parsons,Sarah G D,Quinton Martins,et al.Pulmonary infection due to the dassie bacillus in a free-living dassie from South A frica[J].Tuberculosis,2008,88:80-83.

[10]Shinnick T M,Good R C.Mycobacterial taxonomy[J].Clin Microbiol Infect Dis,1994,13:884-901.