家兔呼吸道疾病病原分離鑒定與藥敏試驗(yàn)

袁定勝,王 斌,李旭廷,龔 雪

(四川省畜牧科學(xué)研究院,四川成都 610066)

隨著家兔養(yǎng)殖的集約化和規(guī)?；?兔場(chǎng)呼吸道疾病呈增加趨勢(shì)。筆者于2009～2010年走訪了成都周邊地區(qū)規(guī)模化兔場(chǎng),發(fā)現(xiàn)該病具有普遍性,患病成年兔表現(xiàn)為流黏液性或膿性鼻涕,打噴嚏,剖檢主要見(jiàn)肺實(shí)變、出血性肺炎、化膿性肺炎或纖維素性胸膜肺炎,成年兔耐受力強(qiáng),一般不死亡,種兔不發(fā)情;患病幼兔表現(xiàn)為流黏液性鼻涕和打噴嚏,急性病例常突然死亡,剖檢多見(jiàn)出血性肺炎。此病給養(yǎng)兔業(yè)帶來(lái)了較大經(jīng)濟(jì)損失。為摸清兔呼吸道疾病的病原及防治方法,本試驗(yàn)采集鼻炎患兔的鼻腔拭子和病死兔的肺臟進(jìn)行檢測(cè),查明病原體,并進(jìn)行藥敏試驗(yàn),為疫病防治提供依據(jù)。

1 材料

1.1 樣本采集 2009年8月至2010年3月從成都周邊地區(qū)6個(gè)規(guī)?；脠?chǎng)采集有呼吸道疾病癥狀家兔樣本60份,其中42份為鼻腔拭子,18份為肺臟樣本。

1.2 試劑、培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)菌株 麥康凱瓊脂(批號(hào)090312);普通肉湯瓊脂(批號(hào) 090115);MH瓊脂(批號(hào)090130);微量生化反應(yīng)管(090808)和藥敏紙片均購(gòu)自杭州天和微生物試劑有限公司;兔鮮血瓊脂平板為本實(shí)驗(yàn)室自制;標(biāo)準(zhǔn)菌株:大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC2801)、金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC1882),購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。所有培養(yǎng)基、玻璃器皿均滅菌后使用。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 昆明系小鼠,清潔級(jí),購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

2 試驗(yàn)方法

2.1 病料接種 肺臟病料在無(wú)菌條件下,切取病變和正常組織交界處的小組織塊在培養(yǎng)基瓊脂涂抹接種。鼻腔拭子直接涂抹于瓊脂面邊緣,然后以鉑耳劃線稀釋接種。初次分離均接種鮮血瓊脂平板,置37℃,24 h培養(yǎng)。

2.2 菌落觀察及純培養(yǎng) 觀察菌落形態(tài),是否有溶血,革蘭染色鏡檢。革蘭陽(yáng)性菌接種血平板和普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板,革蘭陰性菌接種血平板和麥康凱瓊脂平板。

2.3 生化試驗(yàn) 以菌落形態(tài)和染色特性做參考,進(jìn)行針對(duì)性的生化試驗(yàn)。疑似葡萄球菌進(jìn)行觸酶試驗(yàn)和血漿凝固酶試驗(yàn)[1-2]。

2.4 致病性試驗(yàn) 將分離的病原菌調(diào)整渾濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁芟喈?dāng),分別腹腔注射小鼠,0.2m L/只,同時(shí)設(shè)置生理鹽水空白對(duì)照,觀察分離菌株的致病性。

2.5 藥敏試驗(yàn) 根據(jù)CLSI推薦的K-B法檢測(cè)分離菌的耐藥性。用于接種巴氏桿菌的MH瓊脂平板含10%兔鮮血。以大腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株做對(duì)照,進(jìn)行藥敏質(zhì)控。

3 結(jié)果與分析

3.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 從42份鼻腔拭子中分離得細(xì)菌48株,其中革蘭陽(yáng)性球菌41株,陰性菌7株。18份肺臟病料中分離得細(xì)菌15株,其中革蘭陽(yáng)性球菌2株,革蘭陰性菌13株。

3.2 形態(tài)描述和染色鏡檢結(jié)果 Ⅰ類(lèi)菌10株,革蘭陰性球桿菌,在鮮血瓊脂平板上生長(zhǎng)較快,針尖大小的菌落,透明或略帶灰色,β溶血,麥康凱瓊脂上呈菌落半圓隆起,光滑透明,土黃色,針尖大小,麥康凱平板顏色由紅色變?yōu)辄S褐色。Ⅱ類(lèi)菌4株,革蘭陰性球桿菌,鮮血瓊脂上形成較小的菌落,不溶血,帶有黏液性,灰白色、半透明至不透明,露珠狀,麥康凱瓊脂上不生長(zhǎng)。Ⅲ類(lèi)菌43株,革蘭陽(yáng)性球菌,在鮮血平板和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,在麥康凱平板上不生長(zhǎng)。菌落為針頭大小,呈圓形隆起,灰白或黃白色,部分菌落為金黃色,有β溶血和無(wú)溶血兩種菌落。Ⅳ類(lèi)菌6株,革蘭陰性桿菌,在鮮血平板和普通瓊脂平板上生長(zhǎng)良好,在麥康凱平板上呈粉紅色菌落。菌落為圓形、隆起、不透明。

3.3 生化鑒定結(jié)果 Ⅰ類(lèi)菌不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖,硝酸鹽還原,尿素、氧化酶陽(yáng)性,枸櫞酸鹽、硫化氫、吲哚、明膠液化陰性,判定為支氣管敗血波氏桿菌;Ⅱ類(lèi)菌發(fā)酵葡萄糖和蔗糖,不發(fā)酵乳糖、木糖和七葉苷,硝酸鹽還原,氧化酶、吲哚、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶陽(yáng)性,枸櫞酸鹽、硫化氫、尿素、明膠液化、M.R.、V-P陰性,判定為為多殺性巴氏桿菌;Ⅲ類(lèi)菌中有35株觸酶和凝固酶試驗(yàn)均陽(yáng)性,判定為金黃色葡萄球菌,另外6株為凝固酶陰性葡萄球菌;Ⅳ類(lèi)菌發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、乳糖、木糖,硝酸鹽還原、吲哚、鳥(niǎo)氨酸脫羧酶、枸櫞酸鹽利用、M.R.陽(yáng)性,氧化酶、尿素、硫化氫、V-P陰性,判定為大腸桿菌。

3.4 致病性試驗(yàn) 接種多殺性巴氏桿菌、大腸桿菌和支氣管敗血波氏桿菌的小鼠24～72 h內(nèi)全部死亡,接種金黃色葡萄球菌的小鼠48 h內(nèi)出現(xiàn)精神沉郁等現(xiàn)象,部分死亡,接種凝固酶陰性葡萄球菌的小鼠未觀察到明顯異常。生理鹽水對(duì)照組無(wú)死亡。死亡小鼠從肺臟、肝臟等器官中分離到同種菌。

3.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果 37株金黃色葡萄球菌對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥最嚴(yán)重,耐藥率達(dá)到80%,最敏感的為環(huán)丙沙星,敏感率達(dá)100%,分離菌對(duì)其余藥物都存在不同程度的耐藥。10株支氣管敗血波氏桿菌對(duì)頭孢噻呋、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸鉀、丁胺卡那霉素、慶大霉素、氟喹諾酮類(lèi)敏感;對(duì)青霉素、阿莫西林、林可霉素耐藥。4株巴氏桿菌對(duì)頭孢噻呋、氟喹諾酮類(lèi)、慶大霉素、丁胺卡拉霉素、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸鉀敏感;對(duì)苯唑西林、青霉素、阿莫西林、卡拉霉素、克林霉素、阿奇霉素耐藥。6株大腸桿菌對(duì)頭孢噻呋、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/克拉維酸鉀敏感;丁胺卡那霉素、環(huán)丙沙星中度敏感;對(duì)青霉素、阿莫西林、苯唑西林、慶大霉素、卡那霉素、四環(huán)素、強(qiáng)力霉素、氟喹諾酮類(lèi)和復(fù)方新諾明耐藥,其中1株菌對(duì)亞胺培南耐藥。藥敏結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

4.1 多殺性巴氏桿菌、支氣管敗血波氏桿菌、金黃色葡萄球菌和腸外致病性大腸桿菌是引起家兔呼吸道感染的主要病原菌[2]。筆者本次分離細(xì)菌與沙莎[3]等人1996年報(bào)道的川中南地區(qū)家兔呼吸道細(xì)菌分布基本一致。A juwape等[4]從108只臨床健康兔的鼻腔內(nèi)分離到108株金黃色葡萄球菌,分離率為100%,認(rèn)為葡萄球菌屬是家兔呼吸道常在菌。本次試驗(yàn)從發(fā)病家兔鼻腔中僅分離到2株支氣管敗血性波氏桿菌和1株大腸桿菌,在有肺臟病變的死亡兔肺臟分別分離到8株支氣管敗血性波氏桿菌和5株大腸桿菌,分離菌株對(duì)小鼠均有致病性。結(jié)合臨床觀察,鼻炎癥狀在各個(gè)日齡段均有發(fā)生,肺炎和死亡病例多在斷奶前后發(fā)生。我們認(rèn)為,引起成都周邊兔場(chǎng)嚴(yán)重呼吸道感染的主要病原菌為支氣管敗血波氏桿菌和腸外致病性大腸桿菌,斷奶仔兔感染后癥狀較重,以肺炎為主。多殺性巴氏桿菌和金黃色葡萄球菌為上呼吸道感染病原菌,家兔感染后臨床癥狀表現(xiàn)較輕微,以鼻炎癥狀為主。筆者將對(duì)分離菌株進(jìn)行本動(dòng)物回歸試驗(yàn),考察4種病原菌對(duì)家兔的致病性。

4.2 分離的細(xì)菌均有不同程度的耐藥性。金黃色葡萄球菌顯示出多重耐藥,對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、四環(huán)素類(lèi)、慶大霉素和克林霉素耐藥率在20%～50%,對(duì)復(fù)方新諾明的耐藥率高達(dá)80%,支氣管敗血波氏桿菌對(duì)氨基糖苷類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)抗生素敏感;對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)、林可霉素耐藥。多殺性巴氏桿菌對(duì)氟喹諾酮類(lèi)敏感,與薛瑞辰[5]等人報(bào)道一致。本次分離的大腸桿菌菌株僅對(duì)頭孢噻呋和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑復(fù)合制劑高度敏感;對(duì)四環(huán)素類(lèi)、氟喹諾酮類(lèi)、氨基糖苷類(lèi)和青霉素類(lèi)產(chǎn)生嚴(yán)重耐藥性,部分菌株甚至對(duì)亞胺培南產(chǎn)生耐藥性,其耐藥機(jī)理待進(jìn)一步研究。結(jié)合養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素使用情況,我們分析以上養(yǎng)殖場(chǎng)較多使用了復(fù)方磺胺藥物、青霉素等,導(dǎo)致磺胺類(lèi)藥物和青霉素耐藥率偏高,獸醫(yī)臨床使用較少的頭孢類(lèi)和丁胺卡拉霉素耐藥率較低,也間接說(shuō)明獸用抗生素的不合理使用是臨床耐藥菌產(chǎn)生的一個(gè)重要原因。

4.3 規(guī)范的飼養(yǎng)管理和合理用藥是防治兔呼吸道疾病關(guān)鍵。規(guī)?；脠?chǎng)集約化程度高,飼養(yǎng)環(huán)境和疫病防控措施都影響到家兔的健康。對(duì)有呼吸道癥狀的家兔,應(yīng)及時(shí)做病原分離、鑒定和藥敏試驗(yàn),針對(duì)性使用治療藥物。不合理使用抗生素將破壞家兔體內(nèi)菌群平衡,導(dǎo)致耐藥菌株的滋生。在實(shí)踐中也可采用投喂(飲)清熱抗菌的中藥煎液,可以取得一定的防治效果。

[1] 布坎南R E,吉本斯N E.伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].8版.中國(guó)科學(xué)院微生物研究所《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》翻譯組,譯.北京:科學(xué)出版社,1984:274-521.

[2] 汪洋,趙德明.一起兔支氣管敗血波氏桿菌病的診治[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī),2008(8):93.

[3] 沙莎,王琴,徐興然,等.四川中南地區(qū)冬季家兔呼吸道細(xì)菌分布研究[J].中國(guó)養(yǎng)兔雜志,1999(5):16-17.

[4] A juw ape T P,A regbesola E A.The bacterial flora of the upper respiratory tract of normal rabbits[J].Israel J Vet Med,2002,57:121-123.

[5] 薛瑞辰,張富梅,張立永.氟喹諾酮類(lèi)藥物治療兔巴氏桿菌病效果觀察[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志,2005,41(10):3-34.