2，4，6-三硝基苯酚降解菌的篩選和表征

孫秀云，沈錦優(yōu)，王連軍，李健生，韓衛(wèi)清

(南京理工大學(xué) 環(huán)境與生物工程學(xué)院，江蘇 南京210094)

0 引言

硝基芳香族化合物(Nitro-aromatic compounds，簡(jiǎn)稱NAC)是重要的化工品，廣泛應(yīng)用于火炸藥、農(nóng)藥、殺蟲劑、除草劑、染料、醫(yī)藥等產(chǎn)品的生產(chǎn)［1-2］，這些行業(yè)生產(chǎn)廢水的排放對(duì)環(huán)境造成了嚴(yán)重污染。其中以火炸藥行業(yè)的污染最為嚴(yán)重，問題最為突出。而NAC 難以生物降解，可在環(huán)境中持續(xù)存在并可能在食物鏈中積累，對(duì)人類的毒性大并可引發(fā)嚴(yán)重的環(huán)境污染問題。

NAC 所造成的嚴(yán)重污染問題和NAC 的生物降解性能密切相關(guān)。硝基芳香族化合物由于苯環(huán)上硝基的吸電子作用［3］，苯環(huán)上形成了π 電子的缺電子特性，使好氧微生物加氧酶所催化的親電子氧化攻擊受阻，從而使硝基芳香族化合物難以實(shí)現(xiàn)好氧微生物降解。且該類物質(zhì)的生物降解性能和取代基團(tuán)的數(shù)量有關(guān)［4］。隨著硝基數(shù)目的增加，苯環(huán)上π 電子的缺電子特性增強(qiáng)，顯示出了高度的異型生物質(zhì)特征，生物降解難度加大。單取代的硝基酚、硝基苯等芳香族硝基化合物是可實(shí)現(xiàn)生物氧化降解的，但是多硝基取代的芳香族硝基化合物，例如2，4，6-三硝基甲苯(TNT)、2，4，6-三硝基苯酚(TNP)等顯示出了很大的降解難度。這些難降解物質(zhì)的存在，不僅難以實(shí)現(xiàn)開環(huán)氧化降解，且對(duì)生物處理系統(tǒng)產(chǎn)生了很大的毒害作用，造成了處理效率的降低，甚至微生物的死亡。因此，對(duì)芳香族硝基化合物，尤其是多硝基取代芳香族化合物而言，具有良好的降解能力、并能適應(yīng)該類廢水復(fù)雜水質(zhì)的高效降解微生物的篩選和馴化成為實(shí)現(xiàn)該類物質(zhì)生物處理的關(guān)鍵。

2，4，6 -三硝基苯酚(TNP)是一種重要的硝基芳香族化合物，廣泛應(yīng)用于K·D 復(fù)鹽、二硝基重氮酚(DDNP)等起爆藥生產(chǎn)中。由于TNP 生物降解性能差，目前關(guān)于該物質(zhì)生物轉(zhuǎn)化的實(shí)例尚不多見［4-6］。此外，絕大部分TNP 降解菌株只能實(shí)現(xiàn)部分轉(zhuǎn)化，形成死端產(chǎn)品，而不能實(shí)現(xiàn)TNP 的完全礦化。因此，能夠?qū)崿F(xiàn)TNP 礦化的降解菌株的篩選對(duì)TNP 污染的治理具有重要意義。

本研究從長(zhǎng)期受到TNP 污染的工廠排污口土樣中分離TNP 高效降解菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定和降解機(jī)理的考察，以期為TNP 的生物降解提供菌株資源和可行性依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 培養(yǎng)基

篩選和富集培養(yǎng)液S1 組成如下［4］:3.06 g Na2HPO4·12H2O，0.76 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，0.05 g CaCl2，適量TNP(TNP 的量根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要確定)和微量元素溶液，加入1 000 mL 蒸餾水中。上述S1 培養(yǎng)液加入15 g 瓊脂即為相應(yīng)的S1 固體培養(yǎng)基。

培養(yǎng)液和培養(yǎng)基在使用前均采用高壓滅菌鍋在121 ℃條件下滅菌20～30 min.

1.2 TNP 降解菌株的篩選

試驗(yàn)用土樣取自南京陶吳化工廠排污口。將5 g 土樣與含有50 mg/LTNP 的S1 培養(yǎng)液以1∶100 的質(zhì)量比混合，放入三角瓶中，室溫下以180 r/min 的搖床轉(zhuǎn)速振蕩3 h，得泥水混合物。將泥水混合物稍作沉淀，將上層液體分裝入150 mL 的錐形瓶中(裝液量為50 mL)，搖床培養(yǎng)。約10 d 后，其中兩個(gè)錐形瓶中苦味酸所呈現(xiàn)的黃色褪去。將這兩個(gè)錐形瓶中的泥砂進(jìn)一步沉淀，將該上清液轉(zhuǎn)接到含100 mg/L 苦味酸的S1 培養(yǎng)液中，進(jìn)行菌種的富集。培養(yǎng)48 h 后，培養(yǎng)液褪色，重新轉(zhuǎn)接菌株，進(jìn)一步提高培養(yǎng)液的濃度，重復(fù)該過程直至培養(yǎng)液中TNP 濃度達(dá)到500 mg/L.待TNP 濃度為500 mg/L 的培養(yǎng)液褪色后，將所得的菌懸浮液用無菌蒸餾水逐級(jí)稀釋，涂布于以TNP 為唯一碳源、氮源和能源的篩選培養(yǎng)基S1 平板上，放入培養(yǎng)箱28 ℃倒置培養(yǎng)。觀察菌體生長(zhǎng)情況，并進(jìn)行記錄。兩周后挑取單菌落，在LB 固體培養(yǎng)基上采用采用稀釋涂布的方法進(jìn)行分離純化，進(jìn)行斜面保存并編號(hào)。

1.2.4 TNP 降解菌株的復(fù)篩

挑取分離所得到的單菌落，分別接種于LB 培養(yǎng)液中，搖床培養(yǎng)至對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期。將所得菌體用無菌蒸餾水洗滌過程3 次。將菌體重新懸浮于無菌蒸餾水(調(diào)節(jié)加入的水量，控制菌懸浮液OD600約為2.0)，得到種子液。

將各單菌落的種子液接種于含500 mg/L TNP的S1 培養(yǎng)液中，考察接種菌株的培養(yǎng)液有無顏色變化，如果培養(yǎng)液顏色發(fā)生變化，即可表明TNP 發(fā)生了降解。將TNP 降解菌轉(zhuǎn)接于S1 固體培養(yǎng)基進(jìn)行保存。分別制備各降解菌的種子液，接種于S1 培養(yǎng)液中，定時(shí)取樣，測(cè)定OD600值，并測(cè)定過濾液COD濃度、TNP 濃度，以衡量降解效果，對(duì)篩選得到的TNP 降解菌降解性能進(jìn)行進(jìn)一步的比較。

1.3 TNP 降解菌株的鑒定

1.3.1 降解菌株16S rDNA 的提取

將菌體重新懸浮于150 μL 經(jīng)過滅菌的純凈水中;向離心管中加入10 μL 濃度為5 mg/mL 的溶菌酶用以破碎細(xì)胞壁;向離心管中加入40 μL 濃度為10%的SDS(十二烷基硫酸鈉)，65 ℃下放置30 min;30 min 后，向離心管中加入20 μL 濃度為10 mg/mL 的蛋白酶K，37 ℃下放置4 h;將400 μL 的STE 緩沖溶液(組成為:NaCl，0.1 M;Tris-HCl，10 mM，pH 為8.0;EDTA，1 mM)加入離心管;加入等體積的的苯酚-氯仿，并于12 000 r/min 的轉(zhuǎn)速下離心5 min，將上清液加入新離心管重復(fù)萃取過程，以消除雜質(zhì)影響;萃取完成后，向上清液中加入50 μL醋酸鈉溶液(3 M，pH 為5.2)和1 mL 95%的乙醇，沉淀10 min;將移液槍槍尖剪掉，在酒精燈火焰上燙去邊角，用該槍頭吸取含DNA 的懸液進(jìn)行攪動(dòng);吸取含DNA 的懸液，轉(zhuǎn)入70 μL 無菌純凈水中，備用于下一步的PCR 擴(kuò)增。

1.3.2 降解菌株16S rRNA 基因的PCR 擴(kuò)增及測(cè)序

以總DNA 為模板，用正向引物P1:5'-GAATTTGATCCTGGCTCAGAACGAACGCT-3'(對(duì)應(yīng)于大腸桿菌的第11～37 堿基位置)，反向引物P6:5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTTCAC-3'(對(duì)應(yīng)大腸桿菌的第1 451～1 503 位置)經(jīng)PCR 反應(yīng)擴(kuò)增出16SrDNA.

PCR 反應(yīng)體系(總體積為20 μL):10 ×buffer，2 μL;dNTPs，0.5 μL;正向引物，0.5 μL;反向引物，0.5 μL;MgCl2溶液，2 μL;Taq 聚合酶，0.5 μL;DNA模板，1 μL;ddH2O，13 μL.

PCR 反應(yīng)條件:

1)94 ℃預(yù)變性2 min.

2)94 ℃，1 min;58 ℃，30 secs;72 ℃，2 min(35個(gè)循環(huán)).

3)72 ℃延伸8 min.

4)4 ℃保存.

將得到的目的DNA 進(jìn)行16S rDNA 測(cè)序。測(cè)序儀器為Applied Biosystems 公司生產(chǎn)的3700 DNA Analyzer.

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將得到的1 339bp 序列與美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(National center for biotechnology information，簡(jiǎn)稱NCBI)的GenBank 中核酸數(shù)據(jù)庫(http:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)進(jìn)行同源性對(duì)比，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.4 TNP 降解中間產(chǎn)物分析

為確定TNP 的降解機(jī)理，本研究采用紫外可見光譜、紅外譜圖等分析手段，對(duì)代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析。

配制S1 培養(yǎng)液(含500 mg/L TNP)，接種。搖床培養(yǎng)直至培養(yǎng)液變?yōu)闊o色。用0.22 μm 的濾膜過濾培養(yǎng)液并收集濾液200 mL.將200 mL 降解后的培養(yǎng)液濾液和200 mL 未經(jīng)降解的S1 培養(yǎng)液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在60 ℃條件下分別進(jìn)行濃縮，得到泥狀固體物質(zhì)。將泥狀固體物質(zhì)在烘箱中60 ℃烘干。將得到的干燥固體研磨，進(jìn)行KBr 壓片，測(cè)定得到紅外譜圖。

配制S1 培養(yǎng)液(含500 mg/L TNP)，接種，搖床培養(yǎng)。每隔4 h 取樣，用0.22 μm 的濾膜過濾培養(yǎng)液，將過濾清液稀釋50 倍，進(jìn)行紫外可見光譜掃描分析。

1.5 測(cè)定和分析方法

用紫外可見分光光度計(jì)測(cè)定在波長(zhǎng)為600 nm處的光密度(optical density)OD600值。COD 采用重鉻酸鉀滴定法測(cè)定(GB11914—89)。TNP 濃度采用高效液相色譜法測(cè)定。具體操作如下:取一定量水樣用0.22 μm 的濾膜過濾并適當(dāng)稀釋進(jìn)入色譜柱(Waters RP18 column (5 μm，3.9 ×150 mm))，柱箱溫度35 ℃.流動(dòng)相A:乙腈;流動(dòng)相B:超純水與H3PO4體積比為0.26%;流動(dòng)相A 與B 體積比為3/7.流速為1.00 mL/min.雙極管紫外檢測(cè)器設(shè)定波長(zhǎng)為254 nm，積分出峰面積并由標(biāo)準(zhǔn)曲線確定TNP 濃度。亞硝酸根離子的測(cè)定采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法［4］。細(xì)菌的掃描電鏡觀察過程為:挑取單菌落，用無菌水稀釋，涂片;用4%的戊二醛和1% 的鋨酸固定;采用10%、30%、50%、70%、90%和100%的乙醇梯度洗滌;在臨界點(diǎn)干燥儀內(nèi)進(jìn)行干燥;噴金，掃描電子顯微鏡觀測(cè)并拍照。

2 結(jié)果與討論

2.1 苦味酸降解菌的篩選

經(jīng)過富集和分離，將經(jīng)過純化后所得到的菌株經(jīng)過LB 培養(yǎng)液擴(kuò)大培養(yǎng)，接種入以TNP 為唯一碳源、氮源的S1 培養(yǎng)液中。結(jié)果表明，所得的大部分菌株在以TNP 為唯一碳源和氮源的培養(yǎng)液中無TNP 降解能力(經(jīng)過72 h 的培養(yǎng)，培養(yǎng)液仍然為黃色)。只有接種編號(hào)為NJUST6、NJUST9、NJUST16的菌株的培養(yǎng)液發(fā)生了顏色變化，培養(yǎng)液的顏色由最初的黃色變成橘紅色。繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液紅色消退，培養(yǎng)液變?yōu)闊o色(略帶淺黃)。NJUST6、NJUST9、NJUST16 均可在S1 固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而S1 固體培養(yǎng)基則由初始的亮黃色變?yōu)殚偌t色，最后變?yōu)闊o色。NJUST6、NJUST9、NJUST16 在瓊脂平板上的菌落形態(tài)相似，菌落光滑粘稠，色素為淡黃色;三種菌均呈革蘭氏陽性，好氧;均為桿狀菌，菌體不運(yùn)動(dòng)，不形成分生孢子或內(nèi)孢子;其中NJUST16 菌曾觀察到無色的變異菌株。圖1為NJUST16 的掃描電鏡圖片。

圖1 NJUST16 菌的掃描電鏡圖Fig.1 The Scanning electron micrographs of NJUST16

為了進(jìn)一步考察3 種菌對(duì)TNP 的降解能力，對(duì)3 種菌降解過程中S1 培養(yǎng)液的COD 和TNP 濃度變化情況進(jìn)行了比較。由圖2可見，NJUST6、NJUST9和NJUST16 3 種菌均具有TNP 降解能力。在相同的接種量、相同的起始TNP 濃度、相同的培養(yǎng)歷史、相同的培養(yǎng)條件下，接種NJUST16 菌的體系在32 h內(nèi)可實(shí)現(xiàn)2.18 mM(500 mg/L)TNP 的完全降解;而接種NJUST6、NJUST9 的體系分別需要44 h 左右才能實(shí)現(xiàn)完全降解。此外，3 種菌對(duì)COD 的降解能力也有差異。接種NJUST169 菌的培養(yǎng)液中的COD值經(jīng)過32 h 的降解降到最低點(diǎn)，COD 去除率達(dá)到90%左右;接種NJUST6 和NJUST9 的培養(yǎng)液COD值分別經(jīng)過44 h 達(dá)到最低點(diǎn)，COD 去除率分別為85%和67%.在降解終點(diǎn)，接種NJUST6 和NJUST9的培養(yǎng)液呈淺黃色，而接種NJUST16 的培養(yǎng)液基本呈無色。由此可見，NJUST16 菌相比NJUST6 和NJUST9，具有更強(qiáng)的TNP 降解能力。因此我們最終選取NJUST16 菌作為出發(fā)菌株，對(duì)其進(jìn)行菌種鑒定，研究其降解TNP 的能力、降解機(jī)理，以期實(shí)現(xiàn)該菌的廢水處理應(yīng)用。

圖2 接種NJUST6、NJUST9 和NJUST16 的培養(yǎng)液中COD 和TNP 濃度變化情況Fig.2 The COD and TNP concentration variation in the media inoculated by NJUST6、NJUST9 and NJUST16

2.2 TNP 降解菌的鑒定及降解能力

16S rRNA 在生物中高度保守，素有“生物化石”之稱［7］，已經(jīng)成為一個(gè)分子指標(biāo)，廣泛引用于菌種的鑒定，因此NJUST16 的鑒定主要基于16S rRNA序列分析。將測(cè)序得到的1 339bp 序列輸入到NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中，獲得登陸號(hào)EF635425，用BLAST 工具將NJUST16 與已知的16S rRNA 基因序列進(jìn)行同源性比較。在11 個(gè)與NJUST16 菌株最接近且同源性大于99%的菌株中，有10 株為紅球菌屬(Rhodococcus).一般認(rèn)為序列相似性大于98%即可以認(rèn)為是同種內(nèi)的菌株。此外，結(jié)合NJUST16 菌形態(tài)特征、生理生化反應(yīng)結(jié)果，可以判斷NJUST16菌為紅球菌屬(Rhodococcus)，命名為Rhodococcus sp.NJUST16.

由于TNP 的難生物降解性，目前已見報(bào)道的TNP 降解菌極其有限，主要集中在放線菌類的諾卡氏菌屬(Nocardioides)和紅球菌屬(Rhodococcus)［4-6］.這些降解菌株普遍具有降解速率低、可降解濃度低、降解條件苛刻的缺點(diǎn)。例如，針對(duì)750 mg/L 左右的TNP 的降解，接種Rhodococcus opacus HL PM-1 的體系，需要長(zhǎng)達(dá)8.5 d 的時(shí)間才能實(shí)現(xiàn)TNP 的完全降解［5］;此外這些菌株可處理的TNP 最高濃度在較低，在Weidhaas 等［6］所報(bào)道的接種Rhodococcus opacus strain JW01 的SBR 反應(yīng)體系中，TNP 處理濃度在200 mg/L 以下，且降解過程易受溫度影響。本研究所述的NJUST16 菌，可在32 h 內(nèi)實(shí)現(xiàn)500 mg/LTNP 的完全降解(如圖2所示)。與文獻(xiàn)相比，NJUST16 菌具有較高的降解速率和耐受濃度，具有應(yīng)用潛力。

2.3 NJUST16 對(duì)TNP 的降解中間產(chǎn)物分析

由圖2可知，在NJUST16 的作用下，S1 培養(yǎng)液中TNP 可發(fā)生降解和轉(zhuǎn)化，COD 也有了明顯降低。但是僅憑TNP 濃度和COD 濃度的變化，不能說明在NJUST16 作用下TNP 發(fā)生了礦化。本論文采用紫外可見光譜圖、紅外譜圖等分析手段，確定TNP在NJUST16 作用下的降解機(jī)理，為TNP 實(shí)現(xiàn)礦化提供直接的證據(jù)。

2.3.1 S1 培養(yǎng)液中NJUST16 的生長(zhǎng)、TNP 的降解和亞硝酸根的釋放

如圖3所示，在NJUST16 的作用下，32 h 后S1培養(yǎng)液中TNP 濃度降到檢測(cè)限以下，細(xì)菌濃度達(dá)到最大(最大OD600增量約為0.38).此外，在TNP 降解過程中，可觀察到亞硝酸根離子的釋放。理論上每降解1 mol TNP 可釋放出3 mol 的亞硝酸根離子，而本研究表明每降解1 molTNP 約釋放出2.62 mol的亞硝酸根離子。亞硝酸根離子和降解TNP 摩爾比大于2，表明TNP 分子苯環(huán)上的3 個(gè)硝基均發(fā)生了脫落。

2.3.2 紫外可見光譜圖分析降解中間產(chǎn)物

圖4為含TNP 的S1 培養(yǎng)液在降解過程中的紫外可見光譜圖變化情況。TNP 在354 nm 處和250 nm 處有兩個(gè)特征吸收峰。隨著TNP 的降解，TNP的特征吸收在降低，至40 h TNP 的特征吸收已完全消失，同時(shí)在210 nm 處的吸收峰增強(qiáng)(圖4)。在210 nm 處的吸收峰推測(cè)為亞硝酸根離子及小分子有機(jī)物的特征吸收?？梢奣NP 在NJUST16 的作用下發(fā)生了降解和轉(zhuǎn)化，生成了一些小分子物質(zhì)。

2.3.3 紅外譜圖分析降解中間產(chǎn)物

圖5為含TNP 的S1 培養(yǎng)液在經(jīng)NJUST16 降解前后的紅外譜圖。在降解前，波數(shù)為3 070 cm-1處出現(xiàn)TNP 苯環(huán)的C—H 伸縮振動(dòng);波數(shù)為1 480 cm-1處出現(xiàn)TNP 苯環(huán)的 C==C 伸縮振動(dòng);波數(shù)為1 550 cm-1處出現(xiàn)TNP 苯環(huán)上硝基的反對(duì)稱伸縮振動(dòng);波數(shù)為1 340 cm-1處出現(xiàn)TNP 苯環(huán)上硝基的對(duì)稱伸縮振動(dòng);波數(shù)范圍為675～910 cm-1處出現(xiàn)TNP苯環(huán)的C—H 面外變形振動(dòng)。經(jīng)過NJUST16 的降解，以上吸收峰均得到了顯著的減弱或消失，表明經(jīng)過NJUST16 的降解，TNP 的苯環(huán)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)，同時(shí)發(fā)生了苯環(huán)上硝基脫除的反應(yīng)。

圖3 S1 培養(yǎng)液中NJUST16 的生長(zhǎng)、TNP 的降解和亞硝酸根離子的釋放Fig.3 Growth of NJUST16，degradation of TNP and the release of the nitrite in the S1 media

圖4 NJUST16 降解過程中S1 培養(yǎng)液的紫外光譜圖變化Fig.4 UV spectrum variation of S1 media during the degradation by NJUST16

圖5 TNP 經(jīng)NJUST16 降解前(a)和降解后(b)的傅里葉變換紅外光譜(FTIR)Fig.5 FTIR spectra of TNP before (a)and after (b)degradation by NJUST16

3 結(jié)論

1)利用以TNP 為唯一碳源、氮源的S1 培養(yǎng)基，從長(zhǎng)期受到TNP 污染的工廠排污口土樣中，篩選得到三株可以TNP 為唯一碳源、氮源生長(zhǎng)的菌株，其中NJUST16 菌降解TNP 的能力最為優(yōu)異;

2)NJUST16 菌經(jīng)16S rRNA 鑒定，確定為Rhodococcus，命名為Rhodococcus sp.NJUST16，Gen-Bank 登陸號(hào)為EF635425;

3)對(duì)Rhodococcus sp.NJUST16 降解TNP 的降解產(chǎn)物分析表明，TNP 在Rhodococcus sp.NJUST16的作用下，苯環(huán)上3 個(gè)硝基均發(fā)生了脫落，苯環(huán)發(fā)生了開環(huán)反應(yīng)，并且無明顯的中間產(chǎn)物積累，最終TNP發(fā)生完全礦化。

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