蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在高血壓領(lǐng)域的應(yīng)用

齊連芬，李川潔，胡元會(huì)

高血壓病是臨床常見(jiàn)病之一，隨著人類基因組計(jì)劃的完成，心血管研究趨向于繪制一幅分子生物學(xué)“疾病基因圖譜”。蛋白質(zhì)組學(xué)的應(yīng)用，將基因分析和病理分析串聯(lián)起來(lái)［1］，現(xiàn)就蛋白質(zhì)組學(xué)在高血壓領(lǐng)域的應(yīng)用總結(jié)如下。

1 蛋白質(zhì)組以及蛋白質(zhì)組學(xué)的概念

蛋白質(zhì)組的概念由澳大利亞Wilkins和Willians于1994年提出，指的是由一個(gè)基因組所表達(dá)的全部蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)廣泛參與細(xì)胞的功能及調(diào)節(jié)，蛋白質(zhì)組決定細(xì)胞乃至組織和器官的表型。不論是處于正常狀態(tài)還是急慢性疾病狀態(tài)下［2］。

2 蛋白質(zhì)組學(xué)在高血壓病中的研究

目前國(guó)內(nèi)外的研究大多對(duì)其發(fā)病的機(jī)制感興趣，故研究多集中在高血壓模型動(dòng)物的組織蛋白質(zhì)組學(xué)研究。

2.1 高血壓模型動(dòng)物心肌組織的研究 劉麗等［3］運(yùn)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)探討腹主動(dòng)脈縮窄（AAC）高血壓大鼠（SHR）左心室差異蛋白質(zhì)表達(dá)，及其在左室肥厚發(fā)生機(jī)制中的作用，結(jié)果顯示，鑒定的21個(gè)蛋白質(zhì)中，相對(duì)于假手術(shù)組有14個(gè)蛋白質(zhì)上調(diào)，4個(gè)蛋白質(zhì)下調(diào)，3個(gè)蛋白為AAC組新出現(xiàn)。NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索后發(fā)現(xiàn)上調(diào)蛋白質(zhì)包括：肌球蛋白輕鏈、心肌A肌動(dòng)蛋白蛋白原、B肌球蛋白重鏈、3磷酸甘油醛脫氫酶、線粒體核糖體蛋白L15、G蛋白偶聯(lián)受體34、酪氨酸蛋白激酶ZAP－70、RIKENcDNA 9030617003、天冬氨酸t(yī)RNA合成酶等，下調(diào)蛋白為H轉(zhuǎn)運(yùn)ATP合成酶、卜三脂酰輔酶A脫氫酶等，兩組蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由此認(rèn)為高血壓大鼠心肌中參與糖酵解蛋白、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路蛋白、基因表達(dá)調(diào)控蛋白增加，最終心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白增加導(dǎo)致心肌肥厚。

Jin等［4］運(yùn)用2－DE技術(shù)對(duì)SHR大鼠心肌蛋白表達(dá)進(jìn)行了研究，與Wistar大鼠相比有20個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)，其中13個(gè)點(diǎn)被證明與SHR大鼠早期與血壓維持高水平及其進(jìn)展有關(guān)，而另外7個(gè)在后期高表達(dá)，并且這些高表達(dá)的蛋白可以被血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）類藥物依那普利和氯沙坦逆轉(zhuǎn)。

金賢等［5］取4周、20周齡雄性SHR和 WKY大鼠，SHR在血壓未升高時(shí)就已存在心肌肥厚。經(jīng)二維凝膠圖比較共找出27個(gè)差異蛋白點(diǎn)，質(zhì)譜分析鑒定出20個(gè)差異蛋白，涉及能量代謝、線粒體氧化磷酸化和氧化應(yīng)激反應(yīng)等。

2.2 高血壓模型動(dòng)物腎臟組織的研究 Thongboonkerd［6］運(yùn)用2－DE和MALDI－TOF－MS技術(shù)研究高血壓大鼠腎臟蛋白質(zhì)組表達(dá)的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)腎臟蛋白表達(dá)譜在E－H誘導(dǎo)的高血壓組和SH處理組不同，血管舒緩素結(jié)合蛋白Kallistatin在各組中均有表達(dá)，但僅在長(zhǎng)期E－H30表達(dá)降低。Kallistatin的減少將導(dǎo)致血管中血管舒張因子總量的減少，從而引起或加重高血壓。α1－抗胰蛋白酶A1AT、腎舒血管素活化的抑制因子在EH30組表達(dá)上調(diào)，但在血壓正常的SH30組下調(diào)。此外，平滑肌收縮素（SMCE，包括肌球蛋白）、房肽素和蛋白質(zhì)二硫化物異構(gòu)酶（PDI）在 E－H30組上調(diào)，但在 SH30組下調(diào)。Kallistatin、A1AT、PDI的一致改變提示舒血管素通路在E－H誘導(dǎo)的高血壓發(fā)病機(jī)制中起作用。

杜于茜等［7］研究氯沙坦干預(yù)SHR大鼠后蛋白表達(dá)的變化，兩組凝膠的平均蛋白點(diǎn)數(shù)分別為570±48、686±30。氯沙坦干預(yù)后有13個(gè)蛋白表達(dá)發(fā)生了顯著變化，表達(dá)增強(qiáng)4個(gè)，表達(dá)降低4個(gè)，蛋白點(diǎn)消失5個(gè)。對(duì)13個(gè)差異蛋白點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，鑒定出的7個(gè)蛋白質(zhì)為Heat shock protein（HSP）、Tubulin alpha－1chain、Transthyretinprecursor、Liver regenerationrelated protein LRRG03等。

2.3 高血壓模型動(dòng)物主動(dòng)脈的研究 Delbosc等［8］對(duì)兩種不同種系的高血壓大鼠的主動(dòng)脈進(jìn)行研究，F(xiàn)ischer和Brown Norway（BN）大鼠分別分為對(duì)照組和干預(yù)組［N（Omega）－nitro－L－arginine methyl ester（L－NAME），一種抗高血壓藥物］，結(jié)果顯示BN大鼠干預(yù)組血管重構(gòu)不明顯。運(yùn)用質(zhì)譜技術(shù)對(duì)Fischer大鼠干預(yù)組表達(dá)有差異的蛋白進(jìn)行研究，差異蛋白是：ubiquitin，smooth muscle （SM）22alpha，thymosin beta4，and C－terminal fragment of filamin A。

卞玉蘭等［9］以SHR大鼠胸主動(dòng)脈為研究對(duì)象，結(jié)果在線性pH3～10范圍內(nèi)和分子量120kDa以內(nèi)，SHR的2DE圖分離得到2 338±34個(gè)蛋白點(diǎn)，WKY得到2 102±48個(gè)蛋白點(diǎn)，總共1 870個(gè)點(diǎn)匹配，匹配率約為80%。用軟件對(duì)凝膠圖進(jìn)行分析，選擇有2倍以上差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)有50個(gè)，其中有27個(gè)點(diǎn)在SHR中表達(dá)豐度比WKY高，有23個(gè)點(diǎn)在WKY中表達(dá)豐度比SHR高。通過(guò)膠內(nèi)酶解后進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜，得到20個(gè)蛋白點(diǎn)的PMF圖譜用 Mascot軟件搜索NCBI非冗余庫(kù)，獲得這些蛋白點(diǎn)的身份，結(jié)果總共有10個(gè)點(diǎn)經(jīng)鑒定后具有較可信的結(jié)果，其功能主要有4大類：酶蛋白、信號(hào)通路蛋白、參與胞質(zhì)分裂過(guò)程的蛋白和其他。

2.4 高血壓模型動(dòng)物腦血管的研究 李書林等［10］用自發(fā)性高血壓卒中型大鼠（SHR/SP）試驗(yàn)，結(jié)果表明，青年組 Wistar大鼠腦血管壁明膠酶A（MMP－2）和明膠酶B（MMP－9）的表達(dá)很少，而在SHR/SP組大鼠的血管壁表達(dá)較多。自發(fā)性高血壓大鼠Ⅳ型膠原酶在血管壁表達(dá)的增強(qiáng)，可能是長(zhǎng)期高血壓致使血管內(nèi)皮受到應(yīng)力的損傷，來(lái)自血流的切應(yīng)力和血液的壓力（法向應(yīng)力）作用于血管壁，激發(fā)炎性介質(zhì)的瀑布反應(yīng)有關(guān)。這些因子促進(jìn)平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等的基質(zhì)金屬蛋白酶表達(dá)?；|(zhì)金屬蛋白酶分解ECM而破壞基底層，并開放血－腦屏障是腦卒中病情加重的重要因素。老年組大鼠 MMP－2、MMP－9的表達(dá)也明顯高于青年組，與高血壓大鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是老年鼠由于動(dòng)脈內(nèi)膜的增厚，引起小動(dòng)脈中層的慢性缺血缺氧，導(dǎo)致炎癥介質(zhì)、自由基等的產(chǎn)生增加，從而激活明膠酶，引起一系列病理生理變化。

2.5 高血壓模型動(dòng)物血清、尿蛋白的研究 Sironi等［11］將三種品系的大鼠［SHR，自發(fā)性高血壓易中風(fēng)大鼠（SHR/SP）、Wist－ar大鼠］應(yīng)用鹽負(fù)荷處理一段時(shí)間后，用雙向凝膠電泳等測(cè)定血清和尿中的蛋白改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在中風(fēng)前至少4周SHR/SP血清中就檢測(cè)到炎癥反應(yīng)的標(biāo)志蛋白，包括高水平的硫抑素（thiostatin），在中風(fēng)前和鹽負(fù)荷處理數(shù)周后，SHR/SP尿中就出現(xiàn)一些分泌蛋白（轉(zhuǎn)鐵蛋白、血紅素結(jié)合蛋白、清蛋白、α2－HS糖蛋白、血管舒緩素結(jié)合蛋白、α1－抗胰蛋白酶、Gc－球蛋白和轉(zhuǎn)甲狀腺蛋白），此結(jié)果提示，在磁共振成像檢測(cè)到腦的異常體征前，不典型的炎癥反應(yīng)和廣泛的血管滲透性改變就已經(jīng)發(fā)生。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)在高血壓中醫(yī)證型的研究

“證”是中醫(yī)對(duì)疾病某一階段的特定病理生理過(guò)程的認(rèn)識(shí)，是中醫(yī)理論中的基本概念，也是辨證論治體系的基礎(chǔ)。將蛋白質(zhì)組學(xué)方法引入中醫(yī)“證”的研究，對(duì)中醫(yī)證相關(guān)蛋白質(zhì)進(jìn)行篩選和鑒定，為中醫(yī)“證”本質(zhì)的研究提供新的思路與方法。證的特征與蛋白質(zhì)組有相似之處，且證候的形成及不同治療方法的治療效果必然有其物質(zhì)基礎(chǔ)，而這種物質(zhì)基礎(chǔ)就有可能反映在蛋白質(zhì)變化水平上。

蕭梅芳等［12］研究15例高血壓病肝陽(yáng)上亢證患者及15例高血壓腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果提示：肝陽(yáng)上亢證與肝陽(yáng)化風(fēng)證有6個(gè)相同表達(dá)的蛋白質(zhì)，18個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。鑒定出的蛋白質(zhì)涉及細(xì)胞骨架蛋白、代謝酶類、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白、抗氧化蛋白、血液蛋白等。電壓依賴性陰離子通道蛋白（VDAC）在肝陽(yáng)化風(fēng)組及肝陽(yáng)上亢組表達(dá)下調(diào)，提示兩證與氧化應(yīng)激條件下VDAC下調(diào)，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡有關(guān)。

熊新貴等［13］研究17例高血壓腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證患者、10名健康對(duì)照、23例高血壓肝陽(yáng)上亢證患者的血清蛋白質(zhì)表達(dá)譜。3組血清中共有8個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)呈現(xiàn)差異表達(dá)，鑒定出5個(gè)蛋白質(zhì)為：血清淀粉樣前體蛋白，銅藍(lán)蛋白，維生素D結(jié)合蛋白，載脂蛋白C－Ⅲ和轉(zhuǎn)鐵蛋白。推測(cè)其可能與高血壓腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證存在一定相關(guān)性，其具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 蛋白質(zhì)組學(xué)在高血壓中藥治療中的研究

以蛋白質(zhì)表達(dá)為指標(biāo)，采用蛋白質(zhì)組相關(guān)分析技術(shù)及生物信息學(xué)等方法，通過(guò)比較分析中藥作用前后組織、細(xì)胞的蛋白質(zhì)組，能在分子水平了解中藥的作用靶點(diǎn)及方式、代謝途徑［14］。

張鶯等［15］用平肝潛陽(yáng)方治療高血壓病肝陽(yáng)上亢證大鼠，有12個(gè)表達(dá)差異的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)，鑒定確認(rèn)的8個(gè)。其中異檸檬酸脫氫酶、類固醇合成急性調(diào)節(jié)蛋白在模型組表達(dá)較正常組上調(diào)，在治療組重新下調(diào)至前水平，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組大鼠腎上腺鐵蛋白輕鏈較正常組明顯下調(diào)，經(jīng)治療后又重新上調(diào)至高水平。由此推測(cè)平肝潛陽(yáng)法可以作用于鐵蛋白輕鏈，使其水平提高，從而發(fā)揮其抗氧化應(yīng)激損傷的作用。

趙艷［16］用鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯治療高血壓腦出血患者20例，選取高血壓腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證20例隨機(jī)分為兩組，分別予以鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)證治療及大定風(fēng)珠非對(duì)證治療，結(jié)果顯示，研究共篩選出22個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)。高血壓腦出血肝陽(yáng)化風(fēng)證，經(jīng)鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯對(duì)證治療后與健康對(duì)照組比較2個(gè)蛋白表達(dá)下調(diào)，1個(gè)蛋白缺失，5個(gè)蛋白表達(dá)與健康人無(wú)明顯差異。經(jīng)質(zhì)譜鑒定有8個(gè)蛋白。由此考慮鎮(zhèn)肝熄風(fēng)湯通過(guò)作用于ApoAI，肽酰－脯氨酰－順?lè)词疆悩?gòu)酶A（cyPA），使其水平提高，有效地介導(dǎo)膽固醇和磷脂從人主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的流出從而發(fā)揮降壓降脂作用。

5 展 望

蛋白質(zhì)組研究在心血管疾病中應(yīng)用越來(lái)越廣泛，目前主要受限于敏感性、特異性和高通量［17］。目前中醫(yī)證候及中醫(yī)藥的蛋白質(zhì)組學(xué)研究尚缺乏公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)，研究結(jié)果僅限于蛋白質(zhì)定性，采用不同的檢測(cè)技術(shù)，蛋白定量不同，因而蛋白性質(zhì)也不同，缺乏程度的量化標(biāo)準(zhǔn)。故今后中醫(yī)證候及中醫(yī)藥的蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，應(yīng)逐步建立統(tǒng)一的程度量化標(biāo)準(zhǔn)，以消除不同結(jié)果間的差異。并應(yīng)盡量保證研究的連續(xù)性，深入研究分析這些蛋白質(zhì)，對(duì)差異結(jié)果進(jìn)行再驗(yàn)證和功能分析，尋找更好的干預(yù)靶點(diǎn)。

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