代謝組學(xué)及其在心血管疾病中的研究進(jìn)展

石 潔,胡元會(huì)

1999年英國(guó)皇家理工大學(xué)Nicholson教授及其同事首次提出代謝組學(xué)的概念[1]。代謝組學(xué)是繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后,系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分,是系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,解釋機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)。它通過(guò)高通量、高靈敏度與高精確度的現(xiàn)代分析技術(shù)分析細(xì)胞、組織和體液中內(nèi)源性代謝物整體組成,通過(guò)研究代謝物的動(dòng)態(tài)變化來(lái)辨識(shí)和解析被研究對(duì)象的生理病理狀態(tài)。隨著代謝組學(xué)進(jìn)一步的發(fā)展以及代謝多層次多方面的深入研究,代謝組學(xué)在心血管疾病中取得一些進(jìn)展。本文就代謝組學(xué)及其在心血管疾病研究中的進(jìn)展做一綜述。

1 代謝組學(xué)基本概況

代謝組學(xué)是一門在新陳代謝的動(dòng)態(tài)過(guò)程中,系統(tǒng)研究代謝產(chǎn)物的變化規(guī)律,解釋機(jī)體生命活動(dòng)代謝本質(zhì)的科學(xué)。是一項(xiàng)動(dòng)態(tài)的、多參數(shù)應(yīng)答的新技術(shù)、新方法,反映的是基因、環(huán)境、致病因素、營(yíng)養(yǎng)、藥物、時(shí)間等諸多因素綜合作用于機(jī)體后的總反映,是判定健康、疾病和治療效果合適的分子集合。簡(jiǎn)而言之,基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴我們可能發(fā)生什么,而代謝組學(xué)則告訴我們已經(jīng)發(fā)生了什么[2]。細(xì)胞內(nèi)的生命活動(dòng)離不開物質(zhì)代謝,而基因、蛋白質(zhì)的生命調(diào)控效應(yīng)最終也需落實(shí)在代謝層面上,因此,代謝組學(xué)被認(rèn)為是基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)的延伸,是“組學(xué)”研究的最終方向,它跳過(guò)生命體內(nèi)的復(fù)雜調(diào)控過(guò)程,通過(guò)對(duì)代謝物的分析給出最終的、整體的結(jié)果,這是其在健康評(píng)估、疾病診斷、療效評(píng)價(jià)等方面巨大應(yīng)用前景的優(yōu)勢(shì)所在[3,4]。隨著這些組學(xué)研究的深入,科學(xué)家們逐漸認(rèn)識(shí)到:基因組的變化不一定能夠得到表達(dá),從而并不對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。某些蛋白的濃度會(huì)由于外部條件的變化而升高,但由于這個(gè)蛋白可能不具備活性,從而也不對(duì)系統(tǒng)產(chǎn)生影響。同時(shí),由于基因或蛋白的功能補(bǔ)償作用,某個(gè)基因或蛋白的缺失會(huì)由于其他基因或蛋白的存在而得到補(bǔ)償,最后反應(yīng)的凈結(jié)果為零。而小分子的產(chǎn)生和代謝才是這一系列事件的最終結(jié)果,它能夠更準(zhǔn)確地反映生物體系的狀態(tài)[5]。

代謝組學(xué)關(guān)注的對(duì)象是分子量1 000以下的小分子化合物。根據(jù)研究的對(duì)象和目的不同,Oliver[6]將對(duì)生物體系的代謝產(chǎn)物分析分為4個(gè)層次:①代謝物靶標(biāo)分析(Metabolite target analysis):某個(gè)或某幾個(gè)特定組分的分析;②代謝輪廓分析(Metabolic profiling):少數(shù)預(yù)設(shè)的一些代謝產(chǎn)物的定量分析。如某一類結(jié)構(gòu)、性質(zhì)相關(guān)的化合物(氨基酸、有機(jī)酸等)或某一代謝途徑的所有中間產(chǎn)物或多幾條代謝途徑的標(biāo)志性組分;③代謝組學(xué)(Metabolomics):限定條件下的特定生物樣品中所有代謝組分的定性和定量;④代謝物指紋分析(Metabolic fingerprinting):不分離鑒定具體單一組分,而是對(duì)樣品進(jìn)行快速分類(如表型的快速鑒定)。

完整的代謝組學(xué)流程包括樣品的采集、預(yù)處理、數(shù)據(jù)的采集和數(shù)據(jù)的分析及解釋。通過(guò)測(cè)定生物體液、細(xì)胞提取物、細(xì)胞培養(yǎng)液或組織中代謝物的變化,參照正常代謝信息,將所得的大量數(shù)據(jù)用生物信息學(xué)、化學(xué)信息學(xué)、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行比較分析,發(fā)現(xiàn)其內(nèi)在的聯(lián)系,為臨床提供客觀的信息。檢測(cè)樣本常用的是血漿、尿液、唾液。其研究平臺(tái)主要由分析技術(shù)平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析平臺(tái)構(gòu)成。代謝組學(xué)力求分析生物體系(如體液和細(xì)胞)中所有代謝產(chǎn)物,所以整個(gè)過(guò)程中都強(qiáng)調(diào)盡可能地保留和反映總的代謝產(chǎn)物的信息[7]。支撐起代謝組學(xué)的技術(shù)方法包括:一維核磁共振(1H NM R Spectroscopy,1H-NM R)、氣相層析質(zhì)譜(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS)、液相層析質(zhì)譜(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)、傅立葉層析質(zhì)譜(Fourier T ransform mass spectrometry,FTMS)、高效液相質(zhì)譜(high performance liquid chromatography,HPLC)、電化學(xué)陣列(electrochemical array,EC-array)。運(yùn)用偏最小二乘法,判別分析法(PLS-DA)[8]或人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)[9]等方法建立數(shù)據(jù)模型,就可以對(duì)這些來(lái)自不同樣本的生物學(xué)信息進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

2 代謝組學(xué)在心血管疾病中的研究進(jìn)展

有研究應(yīng)用1H-NMR技術(shù)以36例嚴(yán)重心血管疾病患者和30例心血管動(dòng)脈硬化患者的血清和血漿為研究對(duì)象進(jìn)行了代謝組學(xué)分析,結(jié)合主成分分析(Principal Components Analysis,PCA)、SIMCA(Soft Independent Modelling of Class Analogy)、偏最小乘方分析(PLS-Discriminant Analysis,PLS-DA)、OSCPLS等模式識(shí)別技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對(duì)心血管疾病及其嚴(yán)重程度的判別,得到了＞90%的靈敏度及專一性。Brindle等[10]還運(yùn)用NM R對(duì)不同血壓水平人群進(jìn)行血清代謝組學(xué)檢測(cè)后發(fā)現(xiàn),正常人同血壓偏高一級(jí)高血壓患者存在代謝組學(xué)差異,充分證實(shí)了高血壓的發(fā)生、發(fā)展有著其內(nèi)在的代謝組學(xué)本質(zhì),代謝組學(xué)能夠即時(shí)、靈敏表征高血壓患者的整體功能狀態(tài)變化。

祖國(guó)醫(yī)學(xué)理論體系的基本特點(diǎn)是整體觀念和辨證論治。在整體觀念的指導(dǎo)下,中醫(yī)學(xué)認(rèn)為人體是一個(gè)有機(jī)的整體,各個(gè)組織、器官、系統(tǒng)的功能是相互聯(lián)系、相互影響的。辨證論治是中醫(yī)的精髓,在這里的“證”即指證候,是一個(gè)綜合征,是個(gè)體對(duì)內(nèi)外環(huán)境的整體性反應(yīng)狀態(tài),證候具有復(fù)雜性、模糊性、多樣性和變化性等特點(diǎn)。代謝組學(xué)采用的是“自上而下”式的研究方法,是對(duì)代謝的終端產(chǎn)物進(jìn)行多元化綜合分析,從整體上展示生物體內(nèi)在的變化狀態(tài),避免了以往采用單一指標(biāo)或少數(shù)幾個(gè)指標(biāo)研究某種病理和生理變化[11],這與中醫(yī)學(xué)的整體觀念十分吻合,從而為中醫(yī)證候研究提供嶄新的技術(shù)平臺(tái)。代謝組學(xué)在心血管疾病證候標(biāo)準(zhǔn)化研究中已經(jīng)取得了一些進(jìn)展。

劉衛(wèi)紅等[12]運(yùn)用高脂飼料喂飼法復(fù)制大鼠高脂血癥模型,通過(guò)動(dòng)態(tài)觀察高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病過(guò)程中的代謝產(chǎn)物,探討高脂血癥、動(dòng)脈粥樣硬化痰證、瘀證演進(jìn)過(guò)程中的生命標(biāo)志物,解釋痰瘀證候的動(dòng)態(tài)演變、時(shí)相特點(diǎn)和由痰致瘀的條件。從1H NMR圖譜及模式識(shí)別分析發(fā)現(xiàn):①正常對(duì)照組與模型組之間存在代謝產(chǎn)物譜的證顯著差異,隨著造模時(shí)間延長(zhǎng),模型組不同時(shí)間點(diǎn)樣本之間能較好地分開,說(shuō)明血漿代謝組學(xué)分析較好地反映疾病證候的動(dòng)態(tài)演變;②在1H NMR圖譜中可以發(fā)現(xiàn)乳酸、乙酸、丙氨酸、葡萄糖、氧化三甲胺、O-乙酰糖蛋白、膽堿、極低密度脂蛋白(VLDL)、低密度脂蛋白/高密度脂蛋白(LDL/HDL)、不飽和脂肪酸等的譜峰強(qiáng)度改變較為明顯。乳酸是體內(nèi)三羧酸循環(huán)的中間產(chǎn)物,其代謝異常是能量代謝紊亂的標(biāo)志;丙氨酸的代謝異常與腎小球?yàn)V過(guò)和回收功能有關(guān);乙酸代謝異常則是肝功能損傷的標(biāo)志;膽堿是一種維生素類化合物,它對(duì)細(xì)胞膜完整性及脂類消化運(yùn)輸發(fā)揮重要作用。說(shuō)明高脂血癥大鼠體內(nèi)不僅脂肪和能量代謝紊亂,并存在肝腎功能的損害。③隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng),由2周的VLDL升高,經(jīng)4周時(shí)各種脂肪酸和血糖升高,至8周時(shí)以 N-乙酰糖蛋白、酮體、肌酐以及乳酸升高為主。這些結(jié)果表明,高脂血癥前期以脂質(zhì)代謝紊亂為特點(diǎn),及高脂血癥痰濁的生化物質(zhì)基礎(chǔ),隨著病程進(jìn)展,乙酰糖蛋白,尤其是O-乙酰糖蛋白的出現(xiàn),說(shuō)明凝血機(jī)制出現(xiàn)異常。因?yàn)閰⑴c血液凝固過(guò)程的纖維蛋白原、凝血酶原和集中凝血因子都是糖蛋白。因此,乙酰糖蛋白譜峰的改變可能是高脂血癥大鼠模型血瘀的早期生物標(biāo)志物。

朱萱萱等[13]選取住院并經(jīng)冠脈動(dòng)脈造影確診為冠心病的患者90例,辨證為痰阻心脈、氣陰兩虛、氣虛血瘀及氣滯血瘀4型,采用基于氣相色譜/飛行時(shí)間質(zhì)譜(GC/TOF-MS)的代謝組學(xué)技術(shù)分析冠心病不同證型間的血清代謝物變化規(guī)律。結(jié)果顯示,冠心病患者與健康人、冠心病患者之間在代謝組學(xué)方面存在差異。男性的score plot圖中,健康對(duì)照組、氣虛血瘀證和痰阻心脈證相應(yīng)集中在3個(gè)不同區(qū)域,完全沒(méi)有重疊,區(qū)分度很高。女性的score plot圖中,健康對(duì)照組、氣虛血瘀證、痰阻心脈證和氣陰兩虛證相應(yīng)集中在4個(gè)不同區(qū)域,基本沒(méi)有重疊,區(qū)分度也很高。提示代謝組學(xué)方法可能成為冠心病的病因病機(jī)以及中醫(yī)辨證分型的新研究手段。

簡(jiǎn)維雄等[14]通過(guò)對(duì)心血瘀阻證大鼠血漿的代謝產(chǎn)物、血液流變學(xué)指標(biāo)的變化,以及養(yǎng)心通脈方干預(yù)后指標(biāo)改變的分析識(shí)別,探討大鼠心血瘀阻證血漿代謝產(chǎn)物的“組裝”規(guī)律。將 32只大鼠分為模型組、空白組、養(yǎng)心通脈方組、假手術(shù)組4組,運(yùn)用GC-MS法進(jìn)行血漿代謝組學(xué)研究,鑒定各組共有峰,通過(guò)對(duì)不同組之間代謝產(chǎn)物含量的變化進(jìn)行PCA,同時(shí)檢測(cè)分析各組血液流變學(xué)指標(biāo)。結(jié)果顯示,模型組全血黏度、血漿黏度指標(biāo)高于其余3組;大鼠血漿樣品散點(diǎn)圖顯示模型組與空白組、養(yǎng)心通脈方組、假手術(shù)組完全分離。因子載荷圖表明乳酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘋果酸、硬脂酸、花生四烯酸等代謝物質(zhì)含量明顯增高,果糖含量明顯降低。養(yǎng)心通脈方干預(yù)后代謝物含量、血液流變學(xué)指標(biāo)均不同程度的回調(diào)。因此可以認(rèn)為,發(fā)生改變的乳酸、丙氨酸、纈氨酸、琥珀酸、蘋果酸、硬脂酸、花生四烯酸、果糖等8種代謝物與反映“血瘀”病理的血液流變學(xué)指標(biāo)的改變具有一致性,有可能作為心血瘀阻證代謝性生物標(biāo)志物。

嚴(yán)蓓等[15]建立了心血瘀阻和氣陰兩虛證心肌缺血大鼠模型,基于GC/TOF-MS檢測(cè)技術(shù)的代謝組學(xué)方法,分析血漿中的內(nèi)源性小分子代謝物,發(fā)現(xiàn)兩種中醫(yī)證型和正常大鼠之間代謝圖譜存在明顯差異,數(shù)據(jù)處理和模式識(shí)別后各組可被清晰地區(qū)分,與正常大鼠相比,模型大鼠血漿中羥脯氨酸、蘇糖酸、谷氨酰胺、檸檬酸等化合物的相對(duì)含量發(fā)生了顯著變化。兩種證型大鼠間血漿中纈氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、鳥氨酸、羥脯氨酸、賴氨酸、2-羥基丁酸、3-羥基丁酸、呋喃半乳糖、肌醇等化合物的相對(duì)含量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這些化合物是區(qū)分這兩種中醫(yī)證型的潛在生物標(biāo)志物。研究結(jié)果提示,這兩種證型與能量代謝異常、氧化應(yīng)激反應(yīng)、氨基酸代謝異常等體內(nèi)變化密切相關(guān),此法為探索這兩種基于心肌缺血的中醫(yī)證的科學(xué)內(nèi)涵、病理機(jī)制及科學(xué)“辨證”提供了研究基礎(chǔ)。

3 結(jié) 論

代謝組學(xué)具有巨大的應(yīng)用潛力和科學(xué)價(jià)值,但目前也存在著明顯的不足。對(duì)某一物種、某個(gè)組織或其細(xì)胞中所有代謝途徑中的所有代謝產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行全面高通量的定性和定量分析,在理論上行得通。但目前,沒(méi)有任何一個(gè)分析技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)代謝組中的所有化合物進(jìn)行分析,只能通過(guò)選擇性地提取結(jié)合各種分析技術(shù)的并行分析來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題。代謝組學(xué)分析產(chǎn)生出海量的數(shù)據(jù),但目前尚無(wú)有效數(shù)據(jù)分析手段能夠?qū)⒌玫降娜啃畔⑦M(jìn)行分析和解釋。為了解決這些問(wèn)題,需要從以下幾個(gè)方面進(jìn)行努力:建立更加快速和有效地代謝產(chǎn)物濃度分析方法;建立色譜、電泳和質(zhì)譜原始數(shù)據(jù)處理的方法;建立代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)庫(kù);建立代謝產(chǎn)物數(shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)。如何把代謝組學(xué)數(shù)據(jù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、遺傳學(xué)、酶學(xué)、代謝途徑和表現(xiàn)型分析的數(shù)據(jù)整合在一起,并給出生物學(xué)功能的解釋將是最大的挑戰(zhàn)。因此,有必要對(duì)研究對(duì)象從各個(gè)技術(shù)平臺(tái)平行研究,并進(jìn)行整合,從而對(duì)疾病獲得全面的了解。隨著代謝組學(xué)技術(shù)的不斷進(jìn)步,其在心血管疾病領(lǐng)域的應(yīng)用必將更加廣泛,進(jìn)一步提高心血管疾病的診治水平,提高人們的生活質(zhì)量,延長(zhǎng)壽命,減少社會(huì)醫(yī)療資源的大量浪費(fèi),促進(jìn)社會(huì)經(jīng)濟(jì)和諧發(fā)展。

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