黃芩苷酶解影響因素及其動(dòng)力學(xué)參數(shù)的研究

施春陽(yáng)， 齊香君， 端木艷榮， 錢衛(wèi)東

(1.陜西科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 西安 710021； 2.陜西博森生物制藥股份集團(tuán)有限公司， 陜西 西安 710118)

0 前 言

黃芩苷和黃芩素是黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)中的主要有效成分，具有抗氧化、抗菌消炎、抗病毒、抗腫瘤及止血安胎等藥理作用[1-4].黃芩苷在人體內(nèi)吸收差、轉(zhuǎn)化率低，藥代動(dòng)力學(xué)研究[5]表明：其口服制劑需經(jīng)胃腸道菌叢酶解或肝微粒體轉(zhuǎn)化為黃芩素后被吸收.黃芩素的生物利用度和藥理活性均高于黃芩苷，但在黃芩中含量低、易被氧和堿破壞、生產(chǎn)成本高，從而使其應(yīng)用受到了很大的限制.近幾年研究[6,7]顯示：利用β-葡萄糖苷酶酶解黃芩苷制備黃芩素應(yīng)是可行的方法，可以有效擴(kuò)大黃芩素的來源.因此，筆者對(duì)黃芩苷酶解的影響因素進(jìn)行了考察，并對(duì)酶解過程的動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了初步探索.

1 儀器與材料

752 紫外可見分光光度計(jì)，上海光譜儀器有限公司；760CRT 雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司； CS501-SP 數(shù)顯恒溫器，重慶四達(dá)試驗(yàn)儀器有限公司.

黃芩苷：自制，純度>95 %(HLPC測(cè)定)；β-葡萄糖苷酶：自制酶液(酶活830 U)；黃芩素：純度>98 %(HLPC測(cè)定)；其他實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純.

2 方法與結(jié)果

2.1 酶液制備及酶活測(cè)定

將1 mL酶液1 min內(nèi)酶解底物生成1μg葡萄糖，定義為1個(gè)酶活單位(U).酶液由黑曲霉固體培養(yǎng)，經(jīng)pH 4.8緩沖溶液提取、離心，取上清液即得[8,9]，經(jīng)DNS法[10]測(cè)定酶活為835 U，保存一周復(fù)測(cè)為830 U，即短時(shí)間保存酶活穩(wěn)定.

2.2 黃芩苷酶解率測(cè)定方法

2.2.1 酶解樣品液的制備

精密稱取0.100 g黃芩苷于三角瓶中，加適量pH 4.8緩沖溶液超聲碎至細(xì)粉，加入一定量的酶液，立即保溫?cái)嚢柚烈?guī)定的時(shí)間，即得.

2.2.2 黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

精密稱取恒重的黃芩素10.0 mg，氯仿溶解并定容至100 mL，得黃芩素標(biāo)準(zhǔn)液.分別取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2和1.4 mL標(biāo)準(zhǔn)液于10 mL容量瓶，氯仿定容.以氯仿為空白，274 nm處測(cè)吸光度A.以C(黃芩素濃度，μg·mL-1)對(duì)A進(jìn)行線性回歸，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=0.089 172 6C+0.001 666 7，r=0.999 882，說明黃芩素在2～14 μg·mL-1內(nèi)線性關(guān)系良好.

2.2.3 酶解率的測(cè)定

測(cè)定時(shí)，用氯仿回流提取酶解樣品液數(shù)次，合并氯仿并補(bǔ)至250 mL，稀釋40倍后于274 nm處測(cè)吸光度A，根據(jù)黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線及下式計(jì)算酶解率：

2.3 酶解反應(yīng)速率的測(cè)定

在酶解一定時(shí)間的樣品液中加入適量氯仿回流，終止酶解反應(yīng)，按“2.2.3”測(cè)定吸光度，并按黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線和下式計(jì)算酶解反應(yīng)速率rs：

以上兩式中：C-黃芩素濃度，μg·mL-1；rs-酶解反應(yīng)速率，g·L-1·min-1；m-黃芩苷質(zhì)量，g；Mr1-黃芩素相對(duì)分子質(zhì)量；Mr2-黃芩苷相對(duì)分子質(zhì)量.

2.4 不同因素對(duì)酶解率影響的考察

2.4.1 pH對(duì)酶解率的影響

每份稱黃芩苷0.100 g，加10 mL酶液，分別調(diào)pH至4.0、4.3、4.6、4.9和5.2，于55 ℃酶解1.5 h，按“2.2.3”測(cè)定，結(jié)果見圖1.由圖1可知，pH對(duì)酶解率影響顯著，酶解率隨pH的增大先增加后減少，且黃芩苷酶解最適pH約為4.6.

圖1 pH對(duì)酶解率的影響趨勢(shì) 圖2 酶解溫度對(duì)酶解率的影響趨勢(shì)

2.4.2 溫度對(duì)酶解率的影響

每份稱黃芩苷0.100 g，加10 mL酶液，分別在40、48、55、63和70 ℃下酶解1.5 h，按“2.2.3”測(cè)定，結(jié)果見圖2.由圖2可知，溫度對(duì)酶解率影響明顯，酶解率隨溫度的升高先增強(qiáng)后減弱，且黃芩苷酶解最適溫度約為55 ℃.

2.4.3 加酶量對(duì)酶解率的影響

每份稱黃芩苷0.100 g，分別加0、5、10、15、20、35和40 mL酶液， 于55 ℃酶解1.5 h，按“2.2.3”測(cè)定，結(jié)果見圖3.由圖3可知，在較低的酶濃度下，酶解率隨酶量的增加幾乎呈線性增長(zhǎng).當(dāng)加酶量達(dá)20 mL時(shí)，增長(zhǎng)趨于緩慢并最終在一個(gè)水平上震蕩，故最適加酶量約為20 mL.

圖3 加酶量對(duì)酶解率的影響趨勢(shì) 圖4 酶解時(shí)間對(duì)酶解率的影響趨勢(shì)

2.4.4 酶解時(shí)間對(duì)酶解率的影響

每份稱黃芩苷0.100 g，加10 mL酶液，于55 ℃分別酶解0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.5和5.0 h，按“2.2.3”測(cè)定，結(jié)果見圖4.由圖4可知，1.5 h前酶解率隨時(shí)間幾乎呈線性增長(zhǎng)，符合一般酶解的特點(diǎn)，1.5至2.0 h酶解率增加趨于緩慢，后又急速降低，并在2.5 h后平穩(wěn)并小范圍波動(dòng).綜合考慮，最適酶解時(shí)間約為1.5 h.

2.5 酶解動(dòng)力學(xué)特征參數(shù)的測(cè)定

稱黃芩苷0.040、0.080、0.120、0.160、0.200、0.240和0.280 g，各加10 mL酶液，于55 ℃酶解10 min，按“2.3”測(cè)定rs，并計(jì)算cs/rs值，結(jié)果見表1.

表1 不同初始底物濃度時(shí)的rs 和cs/rs值

酶解反應(yīng)動(dòng)力學(xué)最重要的兩個(gè)特征參數(shù)是米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率rmax，可以根據(jù)表1中數(shù)據(jù)由Hanes-Woolf法[11]求得：最大反應(yīng)速率rmax為0.216 g·L-1·min-1，米氏常數(shù)Km為5.03 g·L-1.

3 結(jié) 論

通過考察不同因素對(duì)黃芩苷酶解反應(yīng)酶解率的影響，獲得了較好的酶解條件：黃芩苷∶酶液為0.1 g∶20 mL、pH 4.6、55 ℃攪拌酶解1.5 h，酶解率可達(dá)70%左右.通過正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)應(yīng)可進(jìn)一步優(yōu)化酶解條件，提高酶解反應(yīng)的酶解率，使黃芩苷酶解制備黃芩素更具實(shí)際意義，為其大量生產(chǎn)提供可靠的依據(jù).

試驗(yàn)得到最大反應(yīng)速率rmax為0.216 g·L-1·min-1，米氏常數(shù)Km為5.03 g·L-1，可見Km非常小，說明β-葡萄糖苷酶與底物黃芩苷親和能力較強(qiáng)，專一性好，酶解反應(yīng)可行且較容易進(jìn)行.

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