合生元益生菌沖劑對小鼠腸道菌群調(diào)節(jié)作用的研究

黃小瓊，劉盛來，鄭佳林，黃虹坤，黃小紅，饒子亮，鐘志勇，唐小江

（廣東省醫(yī)學實驗動物中心，佛山 528248）

微生態(tài)研究表明，腸道微生物是人類健康和疾病的重要決定因素。乳桿菌和雙歧桿菌為腸道益生菌，能調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡，參與營養(yǎng)物質(zhì)代謝，構(gòu)建免疫防御系統(tǒng)，對保證人體健康，預防疾病具有重要作用。腸道內(nèi)由于這些有益菌的存在，使碳水化合物分解產(chǎn)生多種有機酸，而且不產(chǎn)生任何有毒的代謝產(chǎn)物，因此提高了機體的消化機能，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，并且競爭性地抑制某些入侵的病原菌或抑制腸道內(nèi)有害菌的增殖［1］。因此，保持腸道有益菌群的數(shù)量是宿主保持健康的關(guān)鍵因素。合生元益生菌沖劑（兒童型）由嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、低聚果糖、麥芽糊精、香蘭素等組成的保健食品，具有免疫調(diào)節(jié)的保健功能。該品是上市多年的保健品，為臨床使用和調(diào)節(jié)腸道菌群相關(guān)方面實驗研究進一步提供安全有效的實驗證據(jù)，筆者對合生元益生菌沖劑調(diào)節(jié)腸道菌群作用進行實驗研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 動物來源：

選用健康的SPF級BALB/C小鼠20只，雄性，體重18～22g。由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，動物合格證號：0085698。動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（粵）2008-0002，經(jīng)過中心實驗動物倫理委員會批準。

1.2 主要實驗儀器及檢測試劑盒

1.2.1 實驗儀器：

BS-3000A電子天平，上海友聲衡器有限公司生產(chǎn)，感量0.1g。智能生化培養(yǎng)箱：型號：PHX-250，生產(chǎn)廠家：寧波萊?？萍加邢薰尽Ｈ詣訙缇鳎盒吞枺篖MQ.C，廠家：山東新華醫(yī)療器械股份有限公司。電子分析天平：型號：JJ1000，廠家：常熟市雙杰測試儀器長。

1.2.2 實驗藥物及檢測試劑：

1.2.2.1 實驗藥物：法國合生元益生菌沖劑（兒童型）：合生元（廣州）健康產(chǎn)品有限公司生產(chǎn)，規(guī)格：1.5g/袋，批號：1001038。

1.2.2.2 主要檢測試劑：伊紅美籃瓊脂：批號：1012105，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。，疊氮鈉-結(jié)晶紫-七葉苷瓊脂：批號：1003251，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。，BBL瓊脂：批號：100315，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。，Lbs瓊脂：批號：100929，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。，TSC瓊脂：批號：1009032，廠家：北京陸橋技術(shù)有限責任公司。麥氏比濁管：批號：10000198490，廠家：法國biomerieux.sa，API50CHl培養(yǎng)基：批號：863703301，廠家：法國biomerieux.sa，碳水化合物鑒定試劑條API50CH：批號：866264101，廠家：法國biomerieux.sa。

1.2.3 實驗方法［2］

1.2.3.1 動物分組和給藥方法：

將檢疫合格的小鼠20只隨機分為合生元益生菌沖劑組和陰性對照組，每組10只。合生元益生菌沖劑組小鼠每天給予1g/kg·d合生元益生菌沖劑1次/d，連續(xù)給予14d，陰性對照組給予生理鹽水，各組動物每天按20mL/kg體重灌胃給藥。

1.2.3.2 小鼠腸道菌群的檢測

給予樣品之前，提起小鼠尾巴無菌環(huán)境下收集新鮮糞便0.1g，裝于事先滅菌的帶玻璃珠EP管中，加生理鹽水0.9mL，此為稀釋度10-1，立即將EP管封口。于振蕩器上振蕩5min，使糞便均質(zhì)化。將上述振蕩好的標本進行10倍系列稀釋至10-5。選用10-1、10-2、10-3、10-5，用1mL注射器和滅菌吸頭，自高稀釋度向低稀釋度在相應的培養(yǎng)基上各滴加稀釋液50μL，待接種好的培養(yǎng)基吸干后，腸桿菌：伊紅美藍培養(yǎng)基，37℃24h需氧培養(yǎng)；產(chǎn)氣莢膜梭菌：TSC培養(yǎng)基，37℃48h厭氧培養(yǎng)；腸球菌：疊氮鈉結(jié)晶紫七葉苷培養(yǎng)基，37℃48h需氧培養(yǎng)；乳桿菌：LBS培養(yǎng)基，37℃48h培養(yǎng)；雙歧桿菌：BBL培養(yǎng)基，37℃48h厭氧培養(yǎng)。待菌落長出后，以菌落形態(tài)、革蘭染色、生化反應鑒定所需目的菌。培養(yǎng)好的細菌經(jīng)鑒定后計算每克糞便中細菌數(shù)量（CFU·g-1）。選擇菌落適中的稀釋度，算出同一稀釋度平均菌落數(shù)（X）。公式：CFU·g-1標本=X/0.05×稀釋倍數(shù)×1/標本質(zhì)量（g）。結(jié)果用常用對數(shù)值lgCFU·g-1表示。最后一次給予合生元益生菌沖劑之后24h，與實驗前同樣方法取直腸糞便，檢測腸道菌群，方法同上。

2 統(tǒng)計方法

體重采用SPSS16.0軟件進行重復資料方差分析（P＞0.05），菌群數(shù)量采用t檢驗統(tǒng)計。

3 結(jié)果

3.1 一般狀態(tài)

陰性對照組、合生元益生菌沖劑組在給藥期間均正常增長、精神狀態(tài)等未見異常。

3.2 體重

合生元益生菌沖劑組小鼠的體重在給藥第7天與陰性對照組比較均有顯著性差異（P＜0.05），在給藥第14天與陰性對照組比較無顯著性差異（P＞0.05），詳見表1及圖1。

表1 合生元益生菌沖劑對小鼠體重結(jié)果的影響（g，±s）Tab.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice（g，±s）

表1 合生元益生菌沖劑對小鼠體重結(jié)果的影響（g，±s）Tab.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice（g，±s）

注：“*”表示用藥組與陰性對照組比較有顯著性差異P＜0.05Note：compared with control group，“*”P＜0.05

組別Groups 動物數(shù)Number 測定時間Test time D0 First day D7 7 days D14 14 days陰性對照組Normal control group 10 20.6±1.0 22.1±1.5 25.0±0.9合生元益生菌沖劑組BIOSTIME probiotics group 10 20.4±0.8 23.1±0.6*24.4±0.8

圖1 合生元益生菌沖劑對小鼠體重結(jié)果的影響Fig.1 Effect of BIOSTIME probiotics on body weight of mice

3.3 小鼠糞便腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌5種菌群數(shù)量的檢查

合生元益生菌沖劑組與陰性對照組比較腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌5種菌群數(shù)量均無顯著性變化（P＞0.05），合生元益生菌沖劑組灌胃前后自身比較雙歧桿菌數(shù)量有顯著性增加（P＜0.05），合生元益生菌沖劑組灌胃前后自身比較腸桿菌、腸球菌、乳桿菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌數(shù)量有無顯著性變化（P＞0.05）。詳見表2。

表2 合生元益生菌沖劑對小鼠腸道菌群數(shù)量的影響（log±s）Tab.2 Effect of BIOSTIME probiotics on intestinal flora of mice（log±s）

表2 合生元益生菌沖劑對小鼠腸道菌群數(shù)量的影響（log±s）Tab.2 Effect of BIOSTIME probiotics on intestinal flora of mice（log±s）

注：“Δ”表示用藥組灌胃前后自身比較有顯著性差異P＜0.05Note：compared with gavage before and after the group，“Δ”P＜0.05

檢測項目Test處理Process陰性對照組normal control group合生元益生菌沖劑組BIOSTIME probiotics group腸桿菌E.coli 灌胃前Data before feeding 7.13±0.27 7.15±0.35灌胃后Data after feeding 6.71±0.81 6.71±0.64腸球菌Enterococcus 灌胃前Data before feeding 7.42±0.24 7.45±0.16灌胃后Data after feeding 6.91±1.00 7.10±0.57產(chǎn)氣莢膜梭菌Clostridium perfringens 灌胃前Data Before feeding 6.23±0.10 6.25±0.14灌胃后Data after feeding 5.88±0.86 5.80±0.86乳桿菌Lactobacillus 灌胃前Data Before feeding 7.36±0.18 7.40±0.22灌胃后Data after feeding 6.98±0.60 7.04±0.61雙歧桿菌Bifidobacterium 灌胃前Data Before feeding 9.33±0.09 9.24±0.14灌胃后Data after feeding 9.36±0.49 9.64±0.46Δ

3.4 腸桿菌、腸球菌和雙歧桿菌培養(yǎng)基上培養(yǎng)結(jié)果

腸桿菌在EMB培養(yǎng)基上長出黑紫色凸起菌落，有金屬光澤腸球菌在疊氮鈉結(jié)晶紫七葉苷培養(yǎng)基上長出有明顯褐色圈菌落，雙歧桿菌在BBS培養(yǎng)基上長出淡黃色凸起濕潤的小菌落。見彩插2（圖2）

3.5 API50CHl乳桿菌的碳水化合物鑒定結(jié)果

49項API50CHl乳桿菌的碳水化合物鑒定結(jié)果，均符合國標GB/T4789 35-2010有關(guān)乳桿菌的生化特性。見彩插2（圖3）

4 討論

人體體表、體腔內(nèi)存在大量并不致病的微生物群，這些微生物群對其宿主非但無害，而且有益，并有眾多的生理效應。若是內(nèi)外環(huán)境發(fā)生重大變化時，致病微生物群與非致病微生物群之間的平衡就要遭到破壞，發(fā)生微生態(tài)失調(diào)，并引起宿主各種類型的疾病。人體微生態(tài)系統(tǒng)包括口腔、皮膚、泌尿、胃腸道四個微生態(tài)系統(tǒng)，以腸道微生態(tài)系統(tǒng)最為主要、復雜。人體消化道正常菌群包括乳酸桿菌屬、腸道球菌、腸桿菌和擬桿菌屬等［3］。雙歧桿菌、乳桿菌是人腸道中有益菌的代表，主要通過降低腸道PH值、抑制韋永氏球菌、梭菌等腐敗菌增殖，減少腐敗物產(chǎn)生，，同時也因PH下降對病原菌的生存、增殖很不利［4］。

現(xiàn)有微生態(tài)制劑主要有益生菌、益生元和合生素［4］。利用有益活菌制劑以及增殖促進制劑，保證或調(diào)整有益的腸道菌群構(gòu)成，從而收到特定的健康利益是當前國內(nèi)外保健食品開發(fā)有效的、重要的領(lǐng)域。合生元益生菌沖劑是由嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌等有益活菌制劑和低聚果糖、麥芽糊精等有益菌增殖促進劑綜合研制而成。本實驗研究表明，合生元益生菌沖劑（兒童型）可以增加小鼠體重、明顯促進腸道益生菌雙歧桿菌的增殖，進而增強對感染的抵抗力?，F(xiàn)如今，抗生素在抗感染中的廣泛應用是導致機體腸道正常菌群失衡的最重要原因之一。腸道菌群失調(diào)的病因除了原發(fā)于腸道的疾病和全身性疾病以外，還包括抗生素應用不合理、化療和免疫功能低下等。我們通過使用一定量的法國合生元益生菌沖劑，調(diào)整機體的免疫功能和營養(yǎng)狀態(tài)，促進有益菌的增殖，證明了法國合生元益生菌沖劑對腸道菌群的調(diào)節(jié)作用。以上研究結(jié)果為臨床使用合生元益生菌沖劑和相關(guān)方面實驗研究，進一步提供安全有效的實驗證據(jù)。但是，合生元益生菌沖劑對腸道微生物的定植抗力如何尚需進一步研究。

［1］徐永杰，張 波，張祎騰，牛蒡多糖的提取及對小鼠腸道菌群的調(diào)節(jié)作用［J］，食品科學營養(yǎng)衛(wèi)生，2009，30（23）：428-431.

［2］中華人民共和國衛(wèi)生部.保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范（2003年版）［S］.

［3］陳 琛，江振友，宋克玉，等.中草藥對小鼠腸道菌群影響的實驗研究［J］.中國微生態(tài)學雜志，2011，23（1）：15-17

［4］鐘耀廣主編，功能性食品［M］，化學工業(yè)出版社，2004，（1）