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    高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者體外紅細(xì)胞的影響

    2015-04-09 11:22:41董金濤陳麗梁麗紅
    中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)生 2015年2期
    關(guān)鍵詞:紅細(xì)胞

    董金濤+++++陳麗++++梁麗紅

    [摘要] 目的 研究高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者體外紅細(xì)胞的影響。 方法 選取G6PD活性正常、缺乏的檢驗(yàn)者各50例,采集外周血并與槲皮素孵育,測(cè)定紅細(xì)胞的GSH、MetHb,并對(duì)紅細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化進(jìn)行觀(guān)察,考察槲皮素對(duì)G6PD活性缺乏者紅細(xì)胞影響。 結(jié)果 槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞具有明顯的氧化作用,GSH呈下降趨勢(shì),而MetHb則顯著上升(P<0.05),高濃度組MetHb為(5.70±2.03)%顯著高于中、低濃度組(3.51±1.67)%、(1.31±0.68)%,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);缺失組與正常組受到α-萘酚的影響存在明顯差異,且兩種孵育體系中的表現(xiàn)存在不同。 結(jié)論 槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞有一定的氧化作用,因此在涉及含有氧化性黃酮類(lèi)化合物病制劑使用時(shí)應(yīng)謹(jǐn)慎。

    [關(guān)鍵詞] 高濃度槲皮素;G6PD缺乏;紅細(xì)胞

    [中圖分類(lèi)號(hào)] R285 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1673-9701(2015)02-0017-03

    G6PD缺乏者指酶活性因X染色體中G6PD基因改變而出現(xiàn)不同程度的遺傳性疾病,主要表現(xiàn)為溶血性貧血與新生兒黃疸,氧化性藥物等眾多因素均可能為其誘因[1],黃酮類(lèi)化合物通常有抗氧化活性,可放置活性自由基對(duì)機(jī)體造成損傷,但使用不當(dāng)仍可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)不同程度的活性自由基損害及細(xì)胞凋亡[2]。本次研究針對(duì)高濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞的影響進(jìn)行研究,現(xiàn)報(bào)道如下。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    本研究入選的100例受檢者均為男性,在2010年10月~2014年3月在我院接受招募,年齡18~60歲,平均(30.54±7.46)歲,根據(jù)G6PD活性分為G6PD活性正常組與G6PD缺乏組,兩組均為50例,正常組活性≥6.70/gHb,缺乏組<6.70/gHb,兩組年齡等基線(xiàn)資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

    1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

    ①男性;②血常規(guī)、肝腎功能及體格檢查正常;③無(wú)抽煙、嗜酒等不良嗜好;④4個(gè)月內(nèi)未發(fā)生感染性疾病或溶血疾病;⑤兩周內(nèi)未服用藥物;⑥無(wú)其他血液系統(tǒng)疾病;⑦對(duì)試驗(yàn)知情并自愿配合完成試驗(yàn)。所有患者行血常規(guī)、肝腎功能檢查,抽取外周靜脈血20 mL,同時(shí)測(cè)定G6PD活性與體外活性孵育試驗(yàn),上述檢查及試驗(yàn)均在采取后12 h內(nèi)完成。研究方案報(bào)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)。

    1.3 儀器及藥物

    儀器包括全自動(dòng)生化分析儀、紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)、高速冷凍離心機(jī)、水浴恒溫振蕩器、全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀。藥物于中檢所采購(gòu)槲皮素與α-萘酚,使用二甲基亞砜將槲皮素配置為1、5、100 mol·L-1濃度的儲(chǔ)備液,α-萘酚使用二甲基亞砜配置為0.4 mg·mL-1儲(chǔ)備液。使用5 mmol·L-1PBS(5 mmol·L-1葡萄糖,140 mmol·L-1氯化鈉,pH7.4稀釋?zhuān)?duì)儲(chǔ)備液進(jìn)行稀釋處理,濃度為50%。

    1.4 方法

    1.4.1 G6PD活性測(cè)定 利用7170A全自動(dòng)生化分析儀對(duì)G6PD活性進(jìn)行測(cè)定(連續(xù)監(jiān)測(cè)速率法)。通過(guò)離心機(jī)將EDTA-K2抗凝血5 min離心處理,離心參數(shù)為4 000 r/min,避免血漿層干擾吸取20 μL壓積紅細(xì)胞,并將其放入1mL溶解液中溶解,待1~2 min紅細(xì)胞完全溶解后進(jìn)行測(cè)定。參數(shù)設(shè)定:1、2試劑分別為220 μL、25 μL;試驗(yàn)溫度37°C;主波長(zhǎng)及副波長(zhǎng)分別為340 nm、660 nm;反應(yīng)時(shí)間10min;設(shè)置209084為計(jì)算因數(shù)。以U/L表示結(jié)果,后以全自動(dòng)血細(xì)胞分析儀對(duì)Hb進(jìn)行測(cè)定,進(jìn)樣量200 μL取EDTA-K2抗凝血2 mL,最后G6PD活性=G6PD(U/L)/Hb(g/L),并以U/gHb表示結(jié)果。

    1.4.2 紅細(xì)胞孵育 離心全血后分離血漿與白細(xì)胞層,壓積紅用4℃等滲PBS洗滌,洗滌三次后再次將40%體積懸浮于PBS中,制備40%紅細(xì)胞懸液,加入懈皮素,濃度控制在50、250、500 μmol·L-1三個(gè)梯度。分別對(duì)應(yīng)低、中、高組,另外設(shè)立α-萘酚組(0.02 mg·mL-1)、DMSO組(5%)和PBS組,在37℃水浴中放置孵育管,并振蕩孵育2 h。剩下的全血和藥物進(jìn)行孵育,相關(guān)設(shè)置同上。

    1.4.3 GSH測(cè)定 還原性谷胱甘肽用比色法測(cè)定,將孵育完成后的血樣離心處理(10 min,2000 r),將30 μL紅細(xì)胞放置在720 μL蒸餾水中制備溶血液。將300 μL溶血液與1.2 mL GSH試劑混勻后高速離心,后抽取上清液1 mL進(jìn)行顯色反應(yīng),與420 nm處對(duì)吸光度進(jìn)行測(cè)定,另外對(duì)標(biāo)準(zhǔn)管吸光度和空白管吸光度進(jìn)行測(cè)定,最后計(jì)算處GSH含量,公式為GSH=測(cè)定管吸光度-空白管吸光度)/(標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度)×20×307×125/104。

    1.4.4 MetHb檢測(cè) MetHb即高鐵血紅蛋白,其含量結(jié)合630 nm處吸光度的差值,觀(guān)察其和Hb轉(zhuǎn)化為MetHb的比值,用蒸餾水將上述制備溶血液300 μL用閉稀釋為2.55 mL并混勻,將蒸餾水作為空白,在630 nm處測(cè)定吸光度A1;加入50 μL氰化鉀溶液,于上述相同波長(zhǎng)條件下測(cè)定A2。后抽取100 μL溶血液蒸餾水稀釋至2.5 mL,將50 mL高鐵氰化鈉加入,同在630 nm處測(cè)定吸光度A3,另加入50 μL測(cè)定吸光度A4。利用(A1-A2)/(A3-A4)×100%公式將(MetHb)%計(jì)算出來(lái)。

    1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。兩組受試者間的比較采用Students t-test。兩組受試者各藥物組與相應(yīng)對(duì)照組的比較分別采用隨機(jī)區(qū)組的方差分析,并進(jìn)行兩兩之間的LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 40%紅細(xì)胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測(cè)定

    槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞具有明顯的氧化作用,GSH呈下降趨勢(shì),而MetHb則顯著上升(P<0.05),見(jiàn)表1。

    表1 40%紅細(xì)胞懸液G6PD缺乏者GSH及MetHb測(cè)定(x±s)

    注:與低濃度比較,t1=4.925,t2=12.201,t3=4.925,t4=16.660,*P<0.05;與中濃度比較t1=8.331,#P<0.05

    2.2 α-萘酚與DMSO對(duì)GSH及MetHb的影響分析

    缺失組與正常組受到的α-萘酚影響存在明顯差異,兩組孵育體系表現(xiàn)差異顯著,見(jiàn)表2。

    3 討論

    G6PD缺乏者由于紅細(xì)胞中還原性谷胱甘肽對(duì)氧化性物質(zhì)有對(duì)抗作用,使得血紅蛋白、膜脂質(zhì)受到影響,氧化后變?yōu)楦哞F血紅蛋白,促使交聯(lián)細(xì)胞及Heinz形成,使形態(tài)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)明顯變化,最終可能導(dǎo)致紅細(xì)胞破溶,另可能導(dǎo)致經(jīng)內(nèi)皮網(wǎng)狀系統(tǒng)清除[3]。D6PD缺乏者紅細(xì)胞氧化性損害可不斷累積,因此必須防止降低紅細(xì)胞GSH提高氧化性壓力的干擾[4]。

    紅細(xì)胞損傷程度受氧化物質(zhì)損傷的影響受到紅細(xì)胞壓積的影響,當(dāng)紅細(xì)胞壓積較小時(shí),氧化損傷程度則越高。一般情況下成年男性的紅細(xì)胞壓積值約為40%~50%,因此選擇40%紅細(xì)胞懸液孵育體系對(duì)藥物影響紅細(xì)胞氧化作用的考察更為有利[5]??寡趸镔|(zhì)、脂質(zhì)、蛋白等物質(zhì)均處于血漿中,全血中紅細(xì)胞氧化程度輕微,其檢測(cè)客觀(guān)性較高,可準(zhǔn)確反映出生理狀態(tài)[6]。

    α-萘酚可能引發(fā)患者發(fā)生溶血性貧血,使GSH水平降低,另可提高M(jìn)etHb水平上升。槲皮素氧化作用較強(qiáng),在中濃度下即導(dǎo)致可造成較大的氧化性損傷,同時(shí)其能夠使全血中G6PD缺乏者紅細(xì)胞Hb發(fā)生氧化的物質(zhì)[7]。

    有研究顯示,包含槲皮素在內(nèi)的眾多黃酮類(lèi)化合物對(duì)正常者紅細(xì)胞及干細(xì)胞均有一定的氧化作用[8,9],除懈皮素外的黃酮類(lèi)化合物大多需和過(guò)氧化物酶/H202發(fā)生反應(yīng)以參與這一過(guò)程,與黃酮類(lèi)化合物催化氧化機(jī)制符合,但同時(shí)無(wú)法對(duì)其非催化氧化作用做出解釋[10]。有研究顯示[11,12],懈皮素脂性大,可直接氧化Hb,蘆丁具有較高的親水性,較難透過(guò)細(xì)胞膜直接氧化Hb,所以不會(huì)對(duì)G6PD缺乏者、正常者的MetHb和紅細(xì)胞GSH產(chǎn)生明顯影響。

    本次研究對(duì)不同濃度槲皮素對(duì)G6PD缺乏者紅細(xì)胞的氧化作用進(jìn)行研究,而其氧化機(jī)制還需深入研究,可以確定的是槲皮素會(huì)提高缺乏者的氧化性壓力,從而產(chǎn)生氧化性損傷。因此G6PD患者應(yīng)謹(jǐn)慎使用,防止長(zhǎng)期使用高濃度的槲皮素,尤其是新生兒、兒童及感染或遺傳性溶血性疾病等患者應(yīng)避免使用。

    [參考文獻(xiàn)]

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    (收稿日期:2014-09-23)

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