淺談禽白血病的檢測(cè)方法

劉 紅,朱朝輝

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧研究所畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東 廣州 510640)

禽白血病是由禽白血病病毒(ALV)引起的一種傳染性腫瘤病。ALV在雞群中的存在分為A、B、C、D、J、E等多種亞型。近10年所報(bào)道的分離的ALV毒株大部分為J亞群,少部分為A、B亞群。目前國(guó)內(nèi)外已經(jīng)建立了很多ALV的檢測(cè)方法,如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、免疫熒光試驗(yàn)(IFA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、原位雜交(ISH)、熒光定量RT-PCR(QRT-PCR)等。本文就目前國(guó)內(nèi)外禽白血病的檢測(cè)中較常用的一些方法做一簡(jiǎn)述。

1 抗原檢測(cè)方法

1.1 ELISA方法 ELISA方法的特點(diǎn)是特異性、敏感性高,設(shè)備要求低,適合大批量的流行病學(xué)調(diào)查和生產(chǎn)凈化。Ignyatovic等在1982年報(bào)道用抗原捕獲ELISA的方法進(jìn)行GSA p27抗原檢測(cè)。韓靜等用抗A LV-p27的多克隆抗體建立了雙抗體夾心ELISA 方法用于檢測(cè) A、B、J亞群A LV[1]。

目前市場(chǎng)上已有用于檢測(cè)ALVp27抗原ELISA試劑盒出售。不同試劑盒之間敏感性存在差異,郭慧君等對(duì)3種ELISA抗原檢測(cè)試劑盒進(jìn)行靈敏度比較,發(fā)現(xiàn)3者之間靈敏度差異顯著[2]。

在樣品選擇方面,有研究表明蛋清中內(nèi)源性ALV的ELISA反應(yīng)假陽(yáng)性結(jié)果少,因此蛋清樣品被認(rèn)為是ALV抗原ELISA檢測(cè)的理想材料。

1.2 IFA方法 IFA方法可對(duì)抗原進(jìn)行細(xì)胞定位。但是該檢測(cè)方法有時(shí)會(huì)產(chǎn)生非特異性熒光,且僅限于實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。1983年Spencer等就建立了針對(duì)GSA抗原的IF技術(shù),用于自然感染ALV的產(chǎn)蛋母雞的病毒傳播和感染分布檢測(cè)[3]。

1.3 PCR方法

1.3.1 直接PCR 用PCR方法檢測(cè)A LV核酸,是判斷病毒能否復(fù)制的一種指標(biāo)。中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)徐鑌蕊等從病死雞的腫瘤和組織中提取DNA,用設(shè)計(jì)的 ALV-J 引 物 H5/H7(H5:5′-GGATGAGGTGACTAAGAAAG-3′,H7:5′-CGAACCAAAGGTAACACACG-3′)進(jìn)行 PCR擴(kuò)增和序列測(cè)定,從分子水平上證實(shí)了蛋雞J亞群禽白血病的發(fā)生[4]。尹遜河等直接從山東省3個(gè)不同AA肉雞場(chǎng)的雞胚和1日齡雛雞的各組織器官提取DNA,根據(jù)喬彩霞等已經(jīng)發(fā)表的針對(duì) p27的引物序列上游 5′-CCCGTGGAAT TCATGTAG TGAT TAAG-3′和下游 5′-CATACTCGAGGGCTGGATAGCAGACTACAT-3′進(jìn)行了PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物序列測(cè)定,結(jié)果表明,ALV陽(yáng)性檢出率從高到低順序?yàn)槿蹼r＞死胚＞健康雛＞正常胚。在各臟器中以腎臟中的病毒含量最多[5]。

在樣本檢測(cè)方面,Irit Davidson等研究表明作為PCR檢測(cè)的 DNA提取樣本,雞的羽毛尖優(yōu)于肝、脾等臟器[6]。

1.3.2 RT-PCR 與PCR方法相比,RT-PCR方法檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),檢測(cè)成本高。但是它能夠更準(zhǔn)確檢測(cè)病毒的存在。而且有學(xué)者認(rèn)為采用從感染細(xì)胞提取總RNA進(jìn)行RT-PCR,比直接從前病毒DNA進(jìn)行PCR更容易得到完整的GAG和 p27基因。Pham等研究表明,RT-PCR在檢測(cè)蛋清A LV方面比ELISA更加敏感,更易與進(jìn)行 ALV亞型的區(qū)分[7]。Coffinet等報(bào)道了用于鑒定 ALV A、B、C、D、E各個(gè)亞型的RT-PCR引物序列,擴(kuò)增片段長(zhǎng)度在300bp以下[8-10]。

1.3.3 QRT-PCR QRT-PCR是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一種新的檢測(cè)技術(shù)。與傳統(tǒng)PCR相比,具有快速、自動(dòng)化程度高、靈敏度高的特點(diǎn)。Yongbaek Kim等建立了基于ALV-J的特異性引物H5/H7的QRT-PCR技術(shù)用于ALV-J的定量,研究結(jié)果表明,這種QCRT-PCR方法可以定量到25fg的病毒RNA[11]。2008年李佳桃等建立了基于ALV群特異性基因gag基因的QRT-PCR的方法,最低可檢測(cè)82個(gè)拷貝的病毒核酸,與普通PCR方法相比,靈敏度高出1000倍[12]。而林甦等針對(duì)A LV-J ENV基因gp85區(qū)的片段,建立的QRT-PCR方法,檢測(cè)下限為8650個(gè)拷貝[13]。

1.3.4 其他PCR技術(shù) 巢式PCR敏感性高,但也因此最容易受污染。Hitoshi Hatai等建立了從干燥的羽毛干中提取RNA或DNA進(jìn)行ALV鑒定的巢氏PCR技術(shù)[14]。多重PCR可以在一次試驗(yàn)中檢測(cè)出不同的病原。周剛等建立了同時(shí)鑒別內(nèi)、外源性ALV的多重PCR方法。該方法可鑒定所有亞群的A LV[15]。

1.4 ISH IS H可以利用特定核酸順序進(jìn)行病毒RNA的精確定量定位。Arshad S S等利用建立的針對(duì)J亞型ALV GAG或EN V序列的ISH技術(shù)發(fā)現(xiàn)腔上囊是病毒復(fù)制和基因表達(dá)的首選器官[16]。Stedman N L等利用IS H技術(shù)對(duì)自然感染的雞群進(jìn)行ALV-J的定位,發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞、蒲金野氏纖維、腦垂體染色最深,病毒含量最高[17]。

1.5 病毒分離 目前的方法有雞胚分離培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)。該方法適用于ALV的流行病學(xué)調(diào)查和凈化。但該方法的檢測(cè)周期長(zhǎng),技術(shù)要求高,在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用和推廣存在一定難度。

2 抗體檢測(cè)方法

目前市場(chǎng)上已有ALV-AB、J亞型抗體的檢測(cè)試劑盒出售。揚(yáng)州大學(xué)葉建強(qiáng)等利用ALV-J特異性單抗JE29,建立了通過(guò)檢測(cè)A LV-抗原-抗體免疫復(fù)合物來(lái)診斷ALV-J的ELISA方法。該 ELISA具有良好的ALV-J ENV抗原特異性[18]。

在檢測(cè)樣本方面,傳統(tǒng)的抗體檢測(cè)普遍采用血清作為檢測(cè)樣本。但是Garrido M F等發(fā)現(xiàn)接種ALV A亞群標(biāo)準(zhǔn)株 RAV-1的白來(lái)航雞中羽髓(1羽髓加800μL緩沖液稀釋)中抗體水平和1∶500血清中抗體水平相關(guān)性顯著[19],因此認(rèn)為羽髓也是進(jìn)行ALV抗體檢測(cè)的可選樣本。

ALV在雞體內(nèi)的作用機(jī)理很復(fù)雜,雞體的排毒情況也在不斷變化之中,同時(shí)由于雞群個(gè)體差異的存在和檢測(cè)方法的局限性,使用單一一種方法進(jìn)行白血病檢測(cè),存在一定的疏漏。故在檢測(cè)時(shí),如有可能,應(yīng)根據(jù)檢測(cè)目的、雞群代次、檢測(cè)時(shí)期和樣本,采取2～3種方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)。

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