動(dòng)物園珍禽舍內(nèi)大腸桿菌的分離鑒定與耐藥性的試驗(yàn)

伍清林,金蘭梅,周正凱,鄧長林,徐 雪,徐 蕾,李曉峰

(1.金陵科技學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院,江蘇南京210038;2.南京紅山森林動(dòng)物園,江蘇南京210037)

大腸埃希氏菌是人和動(dòng)物腸道中的一種共棲菌,在特定條件下可致大腸桿菌病,并能夠隨著糞便排出而污染環(huán)境。大腸埃希氏菌在空氣中,特別在動(dòng)物舍及其周圍環(huán)境中是一種常見菌。在珍禽養(yǎng)殖中大腸桿菌病也常有發(fā)生,據(jù)報(bào)道[1-3]孔雀、麻雞、珠雞等珍禽均有大腸桿菌病發(fā)生,且發(fā)病率達(dá)50%以上。對于禽大腸桿菌病多采用藥物治療,常用抗菌藥的濫用,大腸桿菌對多數(shù)抗菌藥的耐藥性越來越強(qiáng),臨床上對大腸桿菌病的防治越來越困難。本試驗(yàn)以南京紅山森林動(dòng)物園珍禽繁殖場為研究對象,調(diào)查不同的珍禽大腸桿菌菌含量變化規(guī)律,分離致病性大腸桿菌,通過藥敏試驗(yàn),選用合理有效的抗生素,為動(dòng)物園內(nèi)珍禽的疾病預(yù)防和保健措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物園珍禽繁殖場情況 南京紅山森林動(dòng)物園珍禽繁殖場,在動(dòng)物園內(nèi)小紅山腳下,遠(yuǎn)離動(dòng)物展區(qū)500 m以上,飼養(yǎng)孔雀等十幾種珍禽。禽舍分南北和東西兩種走向,每個(gè)禽舍內(nèi)面積約5～8 m2,有運(yùn)動(dòng)場,每間禽舍飼養(yǎng)的數(shù)量在4～30只不等,每天清掃3次,每周消毒1次(遇到下雨延期)。

試驗(yàn)于2010年1月,選擇藍(lán)孔雀、原雞、白鷴、綠孔雀、白孔雀、麻雞、白冠長尾雉、戴冕鶴、紅腹錦雞等9種珍禽舍進(jìn)行空氣樣本和直腸糞便。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 主要試劑 營養(yǎng)瓊脂(NA)、伊紅美藍(lán)瓊脂(EMB),購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;麥康凱瓊脂(MAC)、沙門菌、志賀氏菌屬瓊脂(S.S.)、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管和藥敏質(zhì)控菌株大腸桿菌ATCC25922,均購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.2 藥敏紙片 共 20種,包括頭孢菌素類6種：頭孢噻吩(CEF)、頭孢哌酮(CFP)、頭孢吡肟(CPM)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢唑啉(CFZ)、頭孢三嗪(CTR);氨基糖苷類5種：鏈霉素(STR)、卡那霉素(KAN)、慶大霉素(GEN)、阿米卡星(AMK)、妥布霉素(TOB);氟喹諾酮類3種：氟羅沙星(FLX)、環(huán)丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOR);青霉素類3種：氧呱嗪青霉素(PIP)、羧芐青霉素(BAR)、氨芐青霉素(AMP);磺胺類：復(fù)方新諾明(SXT);四環(huán)素類：四環(huán)素(TET);硝基呋喃類：呋喃妥因(AHD),購于杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2.3 試驗(yàn)動(dòng)物 普通級小鼠體重18～22 g、普通級家兔,均購于南京盛民科研實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 環(huán)境空氣和珍禽體內(nèi)樣本采集 參照中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)公共場所空氣微生物檢驗(yàn)方法細(xì)菌總數(shù)測定中的自然沉降法[4]采集空氣樣本。在每間禽舍取中央(編號為1)和運(yùn)動(dòng)場(編號為2)2個(gè)點(diǎn),3種培養(yǎng)基,計(jì)6個(gè)平皿,9間禽舍,共計(jì)54個(gè)平皿。瓊脂平板于離地高度為1.2 m,打開平皿蓋暴露空氣中10 min,然后將平皿置37℃恒溫溫箱中培養(yǎng)24 h。

用無菌棉簽從藍(lán)孔雀等9種的泄殖腔拭子涂于MAC、S.S.等培養(yǎng)基上。

1.3.2 大腸桿菌分離鑒定 分別取MAC、S.S.等培養(yǎng)基上典型紅色菌落,涂片,革蘭染色,鏡檢,初步區(qū)分革蘭陽性和陰性菌,然后做腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定,并轉(zhuǎn)接種于伊紅美藍(lán)和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基,觀察反應(yīng)結(jié)果,確認(rèn)大腸桿菌。

1.3.3 致病性試驗(yàn) 將上述生化反應(yīng)已鑒定為大腸桿菌的菌株接種于普通肉湯,37℃培養(yǎng)18 h。取肉湯培養(yǎng)物分別腹腔注射小鼠,每株做3個(gè)重復(fù)。對照組小鼠腹腔注射滅菌生理鹽水0.5 mL/只。觀察小鼠的活動(dòng)及發(fā)病死亡情況,對發(fā)病死亡小鼠立即進(jìn)行剖檢,觀察病變,取其病料涂片,染色,鏡檢,并接種于MAC培養(yǎng)基分離培養(yǎng)。未發(fā)病的繼續(xù)觀察至1周。

1.3.4 藥敏試驗(yàn) 采用WHO推薦的Kirby-Bauer法[5]。依據(jù)NCCLS有關(guān)標(biāo)準(zhǔn),每次測定均以質(zhì)控菌為對照,只有當(dāng)質(zhì)控菌株的抑菌圈直徑在允許范圍內(nèi)測試菌株結(jié)果才有效。判定標(biāo)準(zhǔn)參照美國國家臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(NCCLS)M100-S15[6]和文獻(xiàn)[7],以敏感、中介、耐藥3種形式對抑菌圈大小作出判定。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離與鑒定 從采集的樣本中分離到6種腸桿菌科細(xì)菌,共69個(gè)菌株,其中大腸桿菌27株占分離菌的39.13%(27/69),9種珍禽舍內(nèi)和體內(nèi)均分離到大腸桿菌,達(dá)100%的分離率,說明大腸桿菌在珍禽舍環(huán)境中和體內(nèi)普遍存在。結(jié)果見表1。

分離到了27株大腸桿菌,在伊紅美藍(lán)瓊脂上均形成黑色、帶金屬光澤的菌落,均為革蘭陰性、兩端鈍圓的小桿菌、單在或成對存在。各菌均可發(fā)酵葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露醇,產(chǎn)酸產(chǎn)氣;少數(shù)菌株發(fā)酵蔗糖,只產(chǎn)酸或產(chǎn)酸并產(chǎn)氣;M.R.試驗(yàn)陽性;V-P試驗(yàn)陰性;產(chǎn)生靛基質(zhì);尿素酶試驗(yàn)陰性;硝酸鹽還原試驗(yàn)陽性;吲哚試驗(yàn)陽性;枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)陰性;三糖鐵斜面、底層產(chǎn)酸變黃,有氣體,無變黑現(xiàn)象。

表1 珍禽環(huán)境空氣中的腸桿菌科菌數(shù) (株)

2.2 動(dòng)物致病性試驗(yàn) 27株大腸桿菌接種小鼠后,24 h內(nèi)有14株接種的42只小鼠精神委靡,腹瀉,飲水增加,有水樣糞便后死亡;有8株接種的24只小鼠,接種后出現(xiàn)不同程度的精神沉郁、拉稀等臨床癥狀,72 h內(nèi)有16只死亡,其余的8只48 h后漸漸開始恢復(fù),至72 h時(shí)基本已恢復(fù)至健康狀態(tài);其余健活。剖檢死亡小鼠均見內(nèi)臟充血,肝臟腫大,有出血點(diǎn)和壞死點(diǎn);腸嚴(yán)重臌氣,腸管變薄,心包淤血,肺出血,脾臟淤血。從死亡小鼠的心血和肝臟中均分離出大腸桿菌。由此可見,27株大腸桿菌有14株致病性較強(qiáng),8株有致病性,5株無致病性。

2.3 耐藥性監(jiān)測 選擇20種抗菌藥物對9種珍禽舍環(huán)境中和珍禽體內(nèi)的18株大腸桿菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn),20種抗菌藥物中抑菌作用最強(qiáng)的為CEF、TOB、STR和AHD,敏感菌株占(17/18)94.44%;其次為 CFP、KAN、AMK(16/18),(88.89%);CPM(14/18)(77.78%);CTR、GEN(13/18),(72.22%)。18株大腸桿菌對抗菌藥物均表現(xiàn)出不同程度的耐藥性,耐藥菌株分別占BAR(18/18),(100%);NOR(16/18),(88.89%);PIP、AMP(15/18),(83.33%);CIP、TET(14/18),(77.78%);FLX(9/18),(50%)。結(jié)果見表2和表3。

表2 18株大腸桿菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果 (mm)

2.4 大腸桿菌的耐藥性和耐藥類型 18株受試大腸桿菌均對20種抗菌藥物有多重耐藥性,表現(xiàn)對4種或4種以上藥物耐藥。7耐菌株所占比例最大,為22.22%(4/18);其次是5耐和9耐均為16.67%。多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重,最少為4種,最多為12種。最普遍的耐藥類型是BAR-AMP-TET-CIP-NOR-PIPFLX,其次為 BAR-AMP-TET-SXT-CIP-NOR-PIPFLX。見表4。

表3 20種抗菌藥物對18株大腸桿菌耐藥性監(jiān)測試驗(yàn)結(jié)果

表4 18株大腸桿菌耐藥譜型

3 小結(jié)與討論

3.1 動(dòng)物園繁殖場飼養(yǎng)的各種珍禽數(shù)量雖然少,但是種類多,飼養(yǎng)環(huán)境同其他畜牧場所相似,都屬于集約化養(yǎng)殖,據(jù)動(dòng)物園病例記載,在珍禽中常有大腸桿菌病發(fā)生。本試驗(yàn)從9間珍禽舍的環(huán)境空氣中和9種珍禽體內(nèi)分離到大腸桿菌27株,其中14株致病性較強(qiáng),致病率占58.33%,說明動(dòng)物園繁殖場珍禽舍已受到致病性大腸桿菌的污染,平時(shí)應(yīng)注意監(jiān)測,做好消毒工作。

3.2 NCCLS早在1993年就頒布了由世界衛(wèi)生組織認(rèn)可的紙片擴(kuò)散法藥敏試驗(yàn)法規(guī),其采用耐藥(R)、中介(I)、敏感(S)三級報(bào)告,且為一菌一藥一判斷界值。本次對18株大腸桿菌耐藥性監(jiān)測的試驗(yàn)結(jié)果是參照NCCLS法規(guī)頒布的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。從藥敏試驗(yàn)結(jié)果可以看出,大腸桿菌敏感率達(dá)70%以上的主要藥物有頭孢噻吩、頭孢哌酮、頭孢吡肟、頭孢三嗪、卡那霉素、慶大霉素、阿米卡星、呋喃妥因等。其中頭孢噻吩、鏈霉素、妥布霉素、呋喃妥因等敏感率達(dá)94.44%,此結(jié)果對于動(dòng)物園珍禽繁殖場有效防治大腸桿菌病具有一定的參考價(jià)值。

3.3 大腸桿菌作為腸道常在菌,在條件變差及其他病原感染后易繼發(fā)致病,并且其血清型眾多、抗原復(fù)雜、容易形成耐藥性,在實(shí)際生產(chǎn)中疫苗預(yù)防和藥物防治效果不理想。目前我國畜禽大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重而復(fù)雜,對大多數(shù)抗菌藥物都已經(jīng)產(chǎn)生了耐藥性[8]。試驗(yàn)的18株大腸桿菌都為多重耐藥菌株,耐藥性最少的菌株耐4種抗菌藥物,耐藥性最多的菌株耐12種,其中以7種耐藥最多。通過18株大腸桿菌對20種抗菌藥物的耐藥類型觀察發(fā)現(xiàn),對氟喹諾酮類耐藥的大腸桿菌,同時(shí)對青霉素類、四環(huán)素等抗菌藥的耐藥率在70%以上。說明受試菌不僅對同一類抗菌藥中數(shù)種抗菌藥物存在交叉耐藥,而且對不同類抗菌藥物存在嚴(yán)重的多重耐藥。這與田勇等[9]報(bào)道的相符。多重耐藥現(xiàn)象的存在,給珍禽大腸桿菌病的藥物防治提出了新的課題。因此,在臨床治療過程中,首先要進(jìn)行藥敏試驗(yàn),可以選擇幾種比較敏感的藥物合用或交替使用,以減少單一藥物的使用劑量或使用時(shí)間,減少耐藥菌株的產(chǎn)生。

3.4 本次試驗(yàn)顯示,細(xì)菌的耐藥性不僅出現(xiàn)在規(guī)模化養(yǎng)殖的家畜家禽中間,在野生禽類中也已經(jīng)出現(xiàn)明顯的耐藥現(xiàn)象,值得廣大科研工作者的關(guān)注。分離的27株大腸桿菌血清型是否相同?是否有同源性?有待于進(jìn)一步研究。

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