硫氧還蛋白和硫氧還蛋白相互作用蛋白與糖尿病腎病關(guān)系的研究進展

趙 璇 郭常輝

(重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科，重慶 400010)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，臨床上一旦發(fā)生，腎臟損害常呈不可逆進展，透析病人中DN患者占20% ～40%〔1〕，故DN的早期診斷及治療對于改善患者生活質(zhì)量及預(yù)后具有重要的臨床意義。DN的發(fā)病機制尚未明了，大量研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機制中發(fā)揮了重要作用。硫氧還蛋白(Trx)及Trx相互作用蛋白(TxnIP)分別參與了氧化應(yīng)激的對抗及介導(dǎo)。本文就Trx、TxnIP、氧化應(yīng)激與DN關(guān)系做一探討，旨在為DN的發(fā)病機制及治療尋求新的突破。

1 Trx

1.1 Trx的生物學(xué)特點 Trx是一種小分子蛋白質(zhì)，分子量約為12 kD，廣泛存在于原核、真核生物中，具有氧化還原活性。它與Trx還原酶(TrxR或TR)、還原型煙酰腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)共同組成一個廣泛分布的NADPH依賴性二硫化物還原酶-Trx系統(tǒng)。該系統(tǒng)都包含有二硫鍵活性位點序列-半胱氨酸-甘氨酸-脯氨酸-(-Cys-Gly-Pro-Cys-)。Trx主要分為Trx-1和Trx-2兩型，Trx-l存在于細胞質(zhì)和細胞核中，Trx-2僅位于線粒體中。Powis等〔2〕通過Western印跡法證實了Trx-2的線粒體定位。目前對Trx-2功能知之甚少，本文中Trx指的是Trx-1。還原型Trx〔Trx-(SH)2〕含有巰基，氧化型Trx(Trx-S2)含有二硫鍵，后者可被TrxR、NADPH還原。Trx還原作用的機制在于其與底物X-S2結(jié)合后，在復(fù)合物的疏水環(huán)境中，Cys32的巰基作為親核物質(zhì)，與蛋白底物結(jié)合形成共價鍵的二硫化物，最后去質(zhì)子的Cys35作用于此二硫化物的二硫鍵，釋放出被還原的蛋白底物。

1.2 Trx的生物學(xué)功能 Trx的主要生物學(xué)功能在于調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)，對抗氧化應(yīng)激。Trx通過多種機制對抗氧化應(yīng)激，其中主要包括兩個方面〔3〕。一方面，它作為電子載體，為生物合成的催化循環(huán)及抗氧化酶類提供氧化還原當(dāng)量，如核糖核苷酸還原酶，蛋氨酸亞砜還原酶，及過氧化還原蛋白;另一方面，通過細胞內(nèi)及細胞間的二硫化物的形成，Trx保護細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白分子防止其聚合或者失活。

另外，Trx的還原形式可抑制凋亡信號調(diào)節(jié)激酶1(ASK1)的活性，從而抑制ASK1依賴性的凋亡〔4〕。ASK1可激活P38MAP激酶和c-Jun N-端激酶(JNK)通道，是腫瘤壞死因子α(TNF-α)誘導(dǎo)凋亡所必需的分子物質(zhì)。Trx還具有維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定、修護再灌注損傷、抑癌及細胞因子樣作用。

2 TxnIP

TxnIP〔又稱維生素D3上調(diào)蛋白1(VDUP-1)或Trx結(jié)合蛋白2(TBP-2)〕，重約50 kD，與抑制類蛋白具有同源性。人們最初在用1，25-二羥維生素D3治療的白血病細胞(HL-60)中發(fā)現(xiàn)了TxnIP。此后，人們用酵母雙雜交系統(tǒng)分離了TxnIP，并認為它是Trx結(jié)合蛋白，對Trx功能及表達具有負性調(diào)節(jié)作用，通過抑制Trx系統(tǒng)的功能而發(fā)揮介導(dǎo)氧化應(yīng)激等作用。Patwari等〔5〕證明了TxnIP與Trx通過巰基交換形成穩(wěn)定的二硫鍵復(fù)合物而發(fā)生相互作用，并發(fā)現(xiàn)了2個對此相互作用十分重要的氨基酸基團-TxnIP63和247位半胱氨酸殘基。

3 TRX和TxnIP與DN的關(guān)系

3.1 氧化應(yīng)激在DN的發(fā)展中起了重要作用 近年來研究表明氧化應(yīng)激在DN的發(fā)病機制中起了重要作用。Hamada等〔6〕通過實驗發(fā)現(xiàn)糖尿病內(nèi)環(huán)境下腎臟中氧化應(yīng)激標志物8-脫羥鳥苷(8-OHdG)及acrolein adduct明顯增多，提示氧化應(yīng)激參與了DN的發(fā)生發(fā)展。多種機制可誘導(dǎo)細胞內(nèi)外的氧化應(yīng)激，包括糖化反應(yīng)，多元醇途徑，蛋白激酶C依賴的膜性NADPH氧化酶的活化，及線粒體內(nèi)的電子傳遞，它們介導(dǎo)了不同組織器官細胞功能的紊亂，如腎小球系膜細胞及內(nèi)皮細胞。為了對抗氧化應(yīng)激，細胞擁有其自身防御機制如內(nèi)源性抗氧化劑。在細胞質(zhì)中，Trx系統(tǒng)及谷胱甘肽/谷氧還蛋白(GSH/GRX)系統(tǒng)對于維持細胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)的平衡起了主導(dǎo)作用〔3〕，它們可減少細胞內(nèi)活性氧(ROS)的產(chǎn)生。已知ROS是細胞內(nèi)級聯(lián)反應(yīng)調(diào)節(jié)劑，過多的ROS的產(chǎn)生會導(dǎo)致氧化應(yīng)激、細胞功能的喪失、甚至細胞的凋亡，且ROS的過多產(chǎn)生與抗氧化應(yīng)激之間的失衡會導(dǎo)致腎小球系膜細胞脂質(zhì)代謝的紊亂，引起腎小球系膜細胞的損害〔7〕。

3.2 Trx及TxnIP在腎臟中的定位與表達 Dutta等〔8〕對健康小鼠的腎臟進行Western印跡法分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn):在腎臟近曲小管細胞中，TxnIP主要分布于細胞核及線粒體中，少量分布于細胞質(zhì)中，在微粒體中幾乎沒有分布。電鏡下進一步發(fā)現(xiàn)，TxnIP存在于腎臟近曲小管細胞的線粒體及細胞核的膜間隙中。Andvani等〔9〕通過實驗研究鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的糖尿病雌性轉(zhuǎn)基因R(TGR，mRen-2)27大鼠及DN患者腎臟中TxnIP與Trx的表達及定位。他們利用定量逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(QRT-PCR)技術(shù)，發(fā)現(xiàn)TxnIPmRNA在糖尿病鼠中的表達較健康對照組增多，Trx在糖尿病鼠與非糖尿病鼠中的表達卻無明顯區(qū)別;進一步研究發(fā)現(xiàn)，TxnIP mRNA在大鼠腎臟的腎小管及遠端腎單位中有大量表達，且TxnIP蛋白的分布與TxnIPmRNA相似;他們在DN患者中得到了與前面所述相同的結(jié)果。與TxnIP相比，大鼠腎臟中Trx基因的表達多局限于皮質(zhì)，內(nèi)側(cè)帶多于外側(cè)帶，并在皮質(zhì)所有結(jié)構(gòu)中均有表達。

3.3 TxnIP與DN 有研究稱〔10〕，高糖環(huán)境下TxnIP的表達依賴于轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)對其的上調(diào)作用，目前認為TGF-β1為細胞因子網(wǎng)絡(luò)的核心，參與了DN腎臟肥大和硬化的發(fā)生、發(fā)展。然而Qi等〔11〕在高糖環(huán)境下培養(yǎng)人類腎臟近曲小管細胞，他們用小分子干擾RNA(siRNA)將TGF-β1基因沉默，發(fā)現(xiàn)高糖環(huán)境下在TGF-β1基因沉默的近曲小管細胞中，TxnIP及其啟動子的活性仍進一步升高，證明高糖環(huán)境誘導(dǎo)TxnIP的升高并非依賴于TGF-β1。

為了探討高糖對腎臟三種不同類型細胞-腎小球系膜(mesangial)細胞、近曲小管細胞及遠曲小管/集合管細胞 TxnIP及Trx基因表達的影響。Advani等〔9〕將三種細胞置于25 mmol/L糖水中培養(yǎng)48 h，與暴露于5.6 mmol/L的糖水中的細胞相比，TxnIP在腎小球近曲小管、遠曲小管及集合管細胞中的表達明顯增加，Trx mRNA在腎小球系膜細胞及遠曲小管/集合管細胞中表達下降，在近曲小管細胞中無明顯影響;胰島素二硫化物還原分析顯示，暴露于高糖環(huán)境下48 h后Trx的生物活性下降了;他們又用siRNA沉默TxnIP基因，培養(yǎng)腎小球系膜細胞及近曲小管細胞，發(fā)現(xiàn)該環(huán)境下高糖對Trx活性的影響減弱了。此實驗揭示了高糖對三種細胞TxnIP及Trx基因表達的影響，進一步證明了TxnIP是Trx活性的負性調(diào)節(jié)劑。

有研究提示腎小球系膜細胞的病理改變在DN的進展中起關(guān)鍵作用。持續(xù)的TxnIP超表達可增加高糖及葡糖胺介導(dǎo)的腎小球系膜外基質(zhì)基因表達及氧化應(yīng)激，引起腎小球系膜細胞的損害，促進DN的進展。Kobayashi等〔12〕通過實驗發(fā)現(xiàn)了TxnIP可導(dǎo)致膠原蛋白在腎小球系膜細胞的沉積。腸促胰島素肽(EX-4)為長效的胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)受體激動劑，可以降低TxnIP在胰島β細胞中的水平;Shao等〔13〕研究表明EX-4-cAMP信號通路可導(dǎo)致蛋白酶體依賴性的TxnIP降解，保護DN患者胰島β細胞，促進胰島素分泌，降低其血糖水平，改善腎臟所處的內(nèi)環(huán)境。

Hamada等〔6〕利用STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠來研究TxnIP在DN發(fā)病機制中可能存在的作用。為了評估實驗組與健康對照組大鼠腎臟中氧化應(yīng)激程度的差別，他們利用酶聯(lián)免疫分析方法檢測大鼠腎臟中氧化應(yīng)激標志物8-OHdG與acrolein adduct的水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，實驗組中兩種標志物明顯升高;利用QRT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，實驗組大鼠腎臟中TxnIP mRNA的表達也高于對照組。既然TxnIP可以與Trx相互作用，該實驗證明了糖尿病內(nèi)環(huán)境促進了TxnIP與Trx的相互作用，抑制Trx的抗氧化應(yīng)激功能，引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平的增加，提示TxnIP可能是糖尿病內(nèi)環(huán)境下氧化應(yīng)激保持高水平的機制。

3.4 Trx超表達抑制DN的進展 近年來研究證實凋亡可導(dǎo)致自身免疫性及藥物性糖尿病胰島β細胞的損害，ROS的細胞毒性可損害1型糖尿病患者的胰島β細胞。Hotta等〔14〕通過實驗證實Trx可保護胰島β細胞，減少凋亡與氧化應(yīng)激對它的損害;Trx在胰腺細胞中的超表達可減少1型糖尿病的發(fā)生。

Hamada等〔15〕對8 w大的雄性Trx轉(zhuǎn)基因鼠(Trx-Tg)與野生型同窩鼠(WT)分別給予鏈脲佐菌素或檸檬酸鹽載體喂養(yǎng)。24 w后，通過對四組小鼠血液及尿液的生化分析及腎臟的組織學(xué)分析，來評估氧化應(yīng)激與糖尿病腎病的腎臟損害程度。結(jié)果顯示:糖化血紅蛋白(HbA1c)水平在糖尿病Trx-Tg與糖尿病WT之間并無顯著差別;而糖尿病Trx-Tg中尿蛋白的排泄卻明顯低于糖尿病WT;與糖尿病WT相比，糖尿病Trx-Tg中TGF-β的表達顯著下降，腎小球系膜基質(zhì)膨脹和腎小管損傷均被抑制;同時，糖尿病Trx-Tg尿中氧化應(yīng)激標志物8-OHdG與acrolein adduct的排泄低于對照組，且它們在腎臟中的免疫染色強度也弱于糖尿病WT，通過Trx的超標達全身及腎臟的氧化應(yīng)激減弱了。這個實驗提示氧化應(yīng)激與DN進展的相關(guān)性以及Trx抑制DN進展的潛在可能性。

4 展望

作為內(nèi)源性氧化應(yīng)激抑制劑，Trx的超標可能對于DN的進展具有抑制作用。最新研究顯示，Trx可保護視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞免受藥物誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損害〔16〕，同時Trx的超標達可通過抑制應(yīng)激誘導(dǎo)的凋亡，對糖尿病鼠的胚胎具有保護作用〔17〕。相反，TxnIP的過度表達介導(dǎo)了氧化應(yīng)激，造成相應(yīng)組織器官的損害。Trx、TxnIP、氧化應(yīng)激與DN之間關(guān)系的研究為DN的發(fā)病機制及治療提供了一個新思路，沉默TxnIP基因、開發(fā)TxnIP抑制劑或Trx激動劑可能成為未來DN治療中新的切入點。

1 Atkins RC，Zimmet P.Diabetic kidney disease:act now or pay later-World Kidney Day，March 2010:We must act on diabetic kidy disease〔J〕.Ther Apher Dial，2010;14(1):1-4.

2 Powis G，Montfort WR.Properties and biological activities of thioredoxins〔J〕.Annu Rev Biophys Biomol Struct，2001;30:421-55.

3 Koháryová M，Kolárová M.Oxidative stress and thioredoxin system〔J〕.Gen Physiol Biophys，2008;27(2):71-84.

4 Saitoh M，Nishitoh H，F(xiàn)ujii M，et al.Mammalian thioredoxin is a direct inhibitor of apoptosis signal-regulating kinase(ASK)1〔J〕.EMBO J ，1998;17(9):2596-606.

5 Patwari P，Higgins LJ，Chutkow WA，et al.The interaction of thioredoxin with Txnip.Evidence for formation of a mixed disulfide by disulfide exchange〔J〕.J Biol Chem，2006;281(31):21884-91.

6 Hamada Y，F(xiàn)ukagawa M.A Possible role of thioredoxin interacting protein in the pathogenesis of streptozotocin-induced diabetic nephropathy〔J〕.Kobe J Med Sci，2007;53(1-2):53-61.

7 Pedzik A，Paradowski M，Rysz J.Oxidative stress in nephrology〔J〕.Pol Merkur Lekarski，2010;28(163):56-60.

8 Dutta KK，Nishinaka Y，Masutani H，et al.Two distinct mechanisms for loss of thioredoxin-bindingprotein-2 in oxidative stress-induced renal carcinogenesis〔J〕.Lab Invest，2005;85(6):798-807.

9 Advani A，Gilbert RE，Thai K，et al.Expression，localization，and function of the thioredoxin system in diabetic nephropathy〔J〕.J Am Soc Neph-rol，2009;20(4):730-41.

10 Chen S，Hong SW，Iglesias-de la Cruz MC，et al.The key role of the transforming growth factor beta system in the pathogenesis of diabetic nephropathy〔J〕.Ren Fail，2001;23(3-4):471-81.

11 Qi W，Chen X，Gilbert RE，et al.High glucose-induced thioredoxin-interacting protein in renal proximal tubule cells is independent of transforming growth factor-β1〔J〕.Am J Pathol，2007;171(3):744-54.

12 Kobayashi T，Uehatr S，Lkeda T，et al.Vitamin D3up-regulated protein-1 regulates collagen expression in mesangial cells〔J〕.Kidney Lnt，2003;64(5):1632-42.

13 Shao W，Yu Z，F(xiàn)antus IG，et al.Cyclic AMPsignaling stimulates proteasome degradation of thioredoxin interacting protein(TxNIP)in pancreatic beta-cells〔J〕.Cell Signal，2010;22(8):1240-6.

14 Hotta M，Tashiro F，Ikegami H.Pancreatic beta cell-specific expression of thioredoxin，an antioxidative and antiapoptotic protein，prevents autoimmune and streptozotocin-induced diabetes〔J〕.J Exp Med，1998;188(8):1445-51.

15 Hamada Y，Miyata S，Nii-Kono T，et al.Overexpression of thioredoxin 1 in transgenic mice suppresses development of diabetic nephropathy〔J〕.Nephrol Dial Transplant，2007;22(6):1547-57.

16 Munemasa Y，Kwong JM，Kim SH，et al.Thioredoxins 1 and 2 protect retinal ganglion cells from pharmacologically induced oxidative stress，optic nerve transection and ocular hypertension〔J〕.Adv Exp Med Biol，2010;664:355-63.

17 Kamimoto Y，Sugiyama T，Kihira T，et al.Transgenic mice overproducing human thioredoxin-1，an antioxidative and anti-apoptotic protein，prevents diabetic embryopathy〔J〕.Diabetologia，2010;53(19):2046-55.