肺癌EGFR突變的TKI靶向治療耐藥機(jī)制研究進(jìn)展

尹威民 王 旭 于明霞 馬克威

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤中心，吉林 長春 130021)

肺癌的治療是根據(jù)患者的機(jī)體情況、腫瘤的病理類型和侵犯范圍等綜合制定治療方案，以便獲得最佳的治療效果。肺癌的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)靶向治療是指以EGFR為靶點(diǎn)，利用EGFR抑制劑特異性的阻斷該分子的生物學(xué)功能，從而阻斷惡性腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為。目前以吉非替尼(Gefitinib)和厄洛替尼(Erlotinib)為代表的EGFR-酪氨酸激酶抑制劑(TKI)正在臨床上用于治療非細(xì)胞肺癌(NSCLC)的分子靶向藥物，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)幾乎所有初始治療有效的患者經(jīng)過治療后，病情出現(xiàn)進(jìn)展即產(chǎn)生了獲得性耐藥，其治療的中位有效時(shí)間為5～9個(gè)月。探討EGFR基因靶向治療耐藥的機(jī)制有利于指導(dǎo)臨床治療。

1 EGFR基因的分子結(jié)構(gòu)與功能

EGFR屬于EGFR受體家族，為跨膜蛋白，由一個(gè)胞外配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)(含催化TK區(qū)域)構(gòu)成。胞外結(jié)構(gòu)有兩個(gè)區(qū)域構(gòu)成包含L1和L2，形成與配體結(jié)合的結(jié)構(gòu);跨膜區(qū)的23個(gè)氨基酸殘基與受體的穩(wěn)定性有關(guān)〔1〕;細(xì)胞內(nèi)為具有酪氨酸激酶活性的區(qū)域，又可分為三個(gè)亞區(qū);近膜亞區(qū)，主要作為蛋白激酶C(PKC)和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶/絲裂原化蛋白激酶(erk/MAPK)作用的負(fù)反饋區(qū)域;隨后的是酪氨酸激酶亞區(qū)，其中第721位為ATP酶結(jié)合位點(diǎn)，EGFR-TKI通過與ATP競爭相應(yīng)的結(jié)合位點(diǎn)，阻止來自配體-受體結(jié)合后的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔2〕;最后的是碳端亞區(qū)。EGFR不但參與正常組織的增殖分化作用，而且在腫瘤細(xì)胞的生長、分化、轉(zhuǎn)移等方面發(fā)揮重要的作用。

2 EGFR基因突變

EGFR基因突變的類型復(fù)雜多樣，目前發(fā)現(xiàn)的突變主要集中在18～21位外顯子，這些外顯子是編碼EGFR-TK結(jié)構(gòu)域的重要部位。(1)19位外顯子突變主要是第746-752位密碼子的缺失突變，導(dǎo)致EGFR蛋白中氨基酸序列丟失，改變了受體ATP結(jié)合囊(ATP-binding poke，ABP)角度，顯著增強(qiáng)了靶向藥物對(duì)腫瘤細(xì)胞的敏感性〔3，4〕;(2)21外顯子的突變均為錯(cuò)義突變，突變主要發(fā)生在858位的L即精氨酸突變?yōu)镽即亮氨酸(L858R)，此突變位點(diǎn)緊鄰激酶活化環(huán)(activation loop)中高度保守的模體，增強(qiáng)了腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性;(3)18外顯子點(diǎn)突變發(fā)生較少，其臨床意義還不明確;(4)20外顯子的突變將在耐藥機(jī)制中介紹。

3 EGFR耐藥機(jī)制的相關(guān)假說

3.1 原發(fā)性耐藥

3.1.1 K-ras突變 K-ras是表皮生長因子受體下游的一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路，兩者都與肺癌的發(fā)生和治療密切相關(guān)。相對(duì)于EGFR的高突變，K-ras的低突變是東亞人群肺腺癌的特征，而西方國家肺癌患者的突變情況則不同，K-ras突變率較高，EGFR突變率較低。另一點(diǎn)與EGFR突變的不同之處為，K-RAS突變與吸煙有關(guān)(P＜0.01)，K-ras突變患者一般都有吸煙史，Eberhard等研究的10例非吸煙患者中都未檢測到K-ras突變〔5〕。更重要的是，EGFR突變和K-ras突變不會(huì)出現(xiàn)在同一個(gè)病例，Tomizawa等研究的120例日本非小細(xì)胞肺癌患者中，29例(24%)存在EGFR突變，4例(3%)存在K-ras突變，而這4例都為EGFR野生型〔6〕。Pao等認(rèn)為K-ras基因突變與吉非替尼的原發(fā)耐藥有關(guān)，在研究的60例肺腺癌患者中，38例對(duì)TKL耐藥的患者，9例(24%)存在K-ras突變，無一例為EGFR突變，17例EGFR突變患者服用TKL都有效，而9例K-ras突變者服用藥物都無效(P=3.2×10-7)〔7〕。由上可見，K-ras基因和EGFR基因是兩個(gè)獨(dú)立的致癌因素，有不同的致病機(jī)理，存在K-ras突變的患者對(duì)吉非替尼不敏感，但K-RAS基因能否作為預(yù)測EGFR野生型、患者對(duì)吉非替尼敏感性的一個(gè)參考指標(biāo)仍有待研究。

3.1.2 蛋白酪氨酸磷酸酶基因(PTEN)的缺失 PTEN基因編碼的蛋白質(zhì)具有脂質(zhì)磷酸酶和蛋白磷酸酶活性，發(fā)揮雙重腫瘤抑制功能。PTEN發(fā)揮腫瘤抑制功能主要通過以下途徑:①PTEN可水解磷酯酰肌醇3磷酸(PIP3)第三位磷酸基團(tuán)，抑制磷酸肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、抑制腫瘤血管生成、逆轉(zhuǎn)細(xì)胞耐藥等作用;②黏著斑激酶(FAK)/促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲與轉(zhuǎn)移。PTEN直接抑制FAK磷酸化，負(fù)向調(diào)控整合素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，亦可同時(shí)抑制細(xì)胞增殖與分化的關(guān)鍵通路-MAPK通路，從而抑制腫瘤的增殖、黏附和侵襲〔8〕;③MDM2(鼠雙微體2)蛋白是 PI3K/Akt的下游分子，被Akt磷酸化激活，由細(xì)胞質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核并與p53結(jié)合后形成 p53-MDM2復(fù)合物，抑制 p53的轉(zhuǎn)錄激活。PTEN抑制Akt活化，導(dǎo)致MDM2在細(xì)胞質(zhì)中降解，促進(jìn)p53的轉(zhuǎn)錄活化。同時(shí)p53與PTEN啟動(dòng)子結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄水平促進(jìn)PTEN表達(dá);④核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)是一類NF家族，PTEN可以直接阻斷細(xì)胞因子誘發(fā)的NF-κB激活，還可以通過抑制IκB降解，使NF-κB牢固結(jié)合于IκB亞基，抑制NF-κB通路引起的腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡抑制作用;⑤哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的效應(yīng)分子，活化后發(fā)揮癌基因的作用。PTEN通過抑制 PI3K/Akt通路的激活，抑制mTOR的活化。PTEN處于多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的共同節(jié)點(diǎn)，若PTEN基因在腫瘤細(xì)胞中發(fā)生突變、缺失、低表達(dá)，就會(huì)導(dǎo)致其抑癌功能減弱或喪失，同時(shí)降低肺癌患者對(duì)EGFR-TKI的療效。功能性的PTEN失活在一些人類腫瘤中普遍存在，如缺乏PTEN蛋白的人NSCLC細(xì)胞株H157對(duì)吉非替尼耐藥，而人NSCLC細(xì)胞株H1355(野生型PTEN)對(duì)吉非替尼敏感〔9〕。下調(diào)PI3K-Akt活性可使治療敏感性恢復(fù)或提高，mTOR抑制劑雷帕霉素(rapamycin)能夠增強(qiáng)PTEN表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的敏感性;運(yùn)用PI3K抑制劑PX-866可克服腫瘤對(duì)吉非替尼產(chǎn)生的耐藥性;將野生型PTEN轉(zhuǎn)染入PTEN表達(dá)缺失的腫瘤細(xì)胞中，可觀察到PI3K/Akt活性降低以及對(duì)EGFR抑制劑的反應(yīng)性提高〔10〕。

3.2 獲得性耐藥

3.2.1 T790M NSCLC的患者經(jīng)過臨床治療顯示，初始對(duì)EGFR-TKI敏感的患者，經(jīng)過約半年的治療后，病情出現(xiàn)進(jìn)展。對(duì)瘤組織基因檢測的結(jié)果顯示:EGFR基因發(fā)生了第二次突變，突變的位點(diǎn)在第20外顯子，即酪氨酸激酶活化域的790位蘇氨酸殘基被蛋氨酸取代，影響了EGFR-TKI預(yù)期靶點(diǎn)的結(jié)合，此研究提示20外顯子T790M突變與EGFR的繼發(fā)性耐藥有關(guān)，且此突變發(fā)生在開始治療與發(fā)生耐藥的階段〔11〕。為進(jìn)一步證實(shí)T790M并非原發(fā)突變，Pao等〔12〕回顧性分析研究了155例NSCLC患者治療前腫瘤組織EGFR，結(jié)果無一例攜帶T790M突變。據(jù)報(bào)道〔13〕，不可逆性 TKI正在進(jìn)入臨床進(jìn)行測試。HKI-272(第二代EGFR-TKI，不可逆性酪氨酸激酶抑制劑)通過共價(jià)鍵結(jié)合于EGFR催化域ATP結(jié)合位點(diǎn)邊緣的Cys-797，由于它和EGFR的結(jié)合方式優(yōu)于傳統(tǒng)的TKI點(diǎn)的非共價(jià)結(jié)合，從而藥物濃度大幅提升并能夠提供持續(xù)的封鎖效應(yīng)，進(jìn)一步增強(qiáng)對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制。研究〔14〕表明，熱休克蛋白90(Hsp90)抑制劑(如CUDC-305)對(duì)不管是否存在T790M突變的腫瘤細(xì)胞都能抑制抑制EGFR-PI3K-AKT和mTOR通路;而且Hsp90抑制劑對(duì)不可逆性和可逆性的TKI耐藥的患者也有效。

3.2.2 IGFR-1(胰島素樣生長因子受體1)過表達(dá) IGFR-1在細(xì)胞生長中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，當(dāng)IGFR-1與配體IGF-Ⅰ/Ⅱ結(jié)合后引起酪氨酸激酶激活，細(xì)胞內(nèi)級(jí)聯(lián)信號(hào)蛋白磷酸化，最終激活轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，并引發(fā)抗凋亡效應(yīng)〔15〕。IGFR-1是EGFR信號(hào)旁路上的激酶受體，其被激活后可啟動(dòng)2條信號(hào)傳遞鏈:Ras/MAPK和PI3K/AKT信號(hào)通路，這兩條通路激活后能促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂與細(xì)胞生長。另外，IGFR-1受體途徑還與其他生長因子相互作用、相互影響。IGFR-1過度表達(dá)就會(huì)大量激活EGFR的下游信號(hào)通路，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞對(duì)EGFR-TKI的低反應(yīng)。有的研究還顯示NSCLC患者中EGFR基因表達(dá)水平較高，相應(yīng)地也伴隨著IGFR-1的高表達(dá)，引起肺癌患者對(duì)EGFR-TKI的繼發(fā)性耐藥。因此，IGFR-1信號(hào)途徑的替代性激活是腫瘤耐受EGFR-TKI的可能途徑之一〔16〕。

3.2.3 酶氨酸激酸類受體(c-MET)擴(kuò)增 原癌基因MET可以通過EGFR3介導(dǎo)的PI3K/AKT信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖，2007年Engelman等提出了耐受EGFR-TKI的另一種機(jī)制即原癌基因MET的擴(kuò)增〔17〕。重組人酪氨酸激酶3(ErbB3)是一種致死性的激酶，是ErbB家族中比較獨(dú)特的成員。為了研究ErbB3是否和EGFR-TKI的耐藥有關(guān)，該研究組構(gòu)建了一株開始對(duì)Gefitinib敏感但暴露在遞增濃度的Gefitinib，6個(gè)月后產(chǎn)生了耐藥克隆的細(xì)胞株，他們發(fā)現(xiàn)這一耐藥歸因于MET原癌基因的擴(kuò)增。MET擴(kuò)增通過以ErbB3介導(dǎo)的PI3K持續(xù)激活下游的信號(hào)通路，從而繞過了EGFR-TKI的靶點(diǎn)EGFR〔18〕。近年來，小分子藥物MET和血管內(nèi)皮生長因子受體-2的抑制劑(XL88O)在Ⅰ期試驗(yàn)中表現(xiàn)出良好的抗腫瘤作用。James等〔19〕在體外試驗(yàn)收集的資料表明證明XL880能夠有效地抑制有MET擴(kuò)增和T790M突變的肺腺癌細(xì)胞的活性，且其比可逆性(erlotinib)和不可逆性的(cl-387，785)TKI效果要好。同時(shí)Engleman等〔17〕研究也表明，目前正在臨床試用的第二代TKI即不可逆性的TKI治療有MET擴(kuò)增的肺癌患者 ，其效果會(huì)不盡如人意，若同時(shí)合并MET激酶抑制劑會(huì)收到好的療效。

3.3 EGFR基因耐藥的其他機(jī)制及前景展望 腫瘤細(xì)胞中存在酪氨酸激酶(TK)受體，TK受體過度表達(dá)就可以避開EGFR而啟動(dòng)EGFR下游信號(hào)的傳導(dǎo)，引起腫瘤細(xì)胞的增殖;上皮細(xì)胞-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)〔20〕，發(fā)生于上皮來源的腫瘤細(xì)胞如肺癌、乳腺癌，與腫瘤細(xì)胞外微環(huán)境的改變有關(guān)。研究表明EGFR耐藥的細(xì)胞株上皮基因表達(dá)下調(diào)，出現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞表型，這就是所謂的EMT現(xiàn)象;EGFR信號(hào)通路可產(chǎn)生部分促血管生成因子，如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長因子(b-FGF)，這些生長因子促進(jìn)腫瘤血管的生成，進(jìn)而加快腫瘤細(xì)胞的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前，多種第二代不可逆性TKI及多激酶抑制劑正在進(jìn)行臨床試驗(yàn)如HKI-272，PF-00299804，LUX-lung等，臨床證據(jù)正在不斷積累〔21，22〕。它和EGFR的結(jié)合方式優(yōu)于傳統(tǒng)的TKI點(diǎn)的非共價(jià)結(jié)合，在T790M的存在下仍保持活性;Hsp90抑制劑、XL880單獨(dú)應(yīng)用或與其他抗癌藥物聯(lián)合應(yīng)用還都沒開展大規(guī)模的臨床試驗(yàn)，這些抗癌藥物不論是在體內(nèi)還是體外療效方面都缺乏足夠的資料，能否用于耐藥患者的治療還需要認(rèn)真仔細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究及臨床測試。

4 結(jié)語

Gefitinib作為一個(gè)EGFR-TKI，相對(duì)于傳統(tǒng)化療具有更大的優(yōu)勢，已經(jīng)成為晚期NSCLC的一種有效的治療措施。EGFR基因的靶向治療在臨床上已開展起來，大多數(shù)起始有效的患者經(jīng)過約5～9個(gè)月治療后，產(chǎn)生了耐藥現(xiàn)象。EGFR基因靶向治療耐藥的出現(xiàn)進(jìn)一步提高了臨床治療肺癌的難度，這也就要求在進(jìn)行靶向治療時(shí)，要綜合考慮基因的突變類型、基因復(fù)制的數(shù)量及患者的病情現(xiàn)狀，制定一個(gè)真正的個(gè)體化靶向治療方案。應(yīng)盡可能多的獲取患者治療前后的臨床資料，對(duì)其病情變化和治療效果進(jìn)行反復(fù)比較，以此來指導(dǎo)抗癌藥物的研制和臨床用藥，最終控制或延緩腫瘤患者的病情發(fā)展，減輕患者的痛苦，改善患者的生活質(zhì)量。

1 Mendrola JM，Berger MB，King MC，et al.The single transmembrane domains of ErbB receptors self-associate in cell membranes〔J〕.J Biol Chem，2002;277(7):4704-12.

2 Pao W，Miller VA.Epidermal growth factor receptor mutations，Smallmolecule kinase inhibitors，and non-small-lung-cancer;current knowledge and future directions〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(11):2556-68.

3 Kosaka T，Yatabe Y，Endoh H，et al.Mutations of the epidermal growth factor receptor or gene in lung cancer:biological and clinical implications〔J〕.Cancer Res，2004;64(24):8919-23.

4 Shigematsu H，Lin L，Takahashi T，et al.Clinical and biological feature associated with epidermal growth factor receptor gene mutations in lung cancers JNCI〔J〕.Natl Cancer Inst，2005;97(5):339-46.

5 Eberhard DA，Johnson BE，Amler LC，et al.Mutations in the ep-idermal growth factor receptor and in KRASare predictive and prognostic indicators in patients with non-small-cell lung cancer treated with chemotherapy alone and in combination with erlotinib〔J〕.J Clin Oncol，2005;23(25):5900-9.

6 Tomizawa Y，Iijima H，Sunaga N，et al.Clinicopathologic significance of the mutations of the epidermal growth factor receptor gene in patients with non-small cell lung cancer〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(19):6816-22.

7 Pao W，Wang TY，Riely GJ，et al.KRASmutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib〔J〕.Plos Med，2005;2(1):17.

8 Shen YH，Zhang L，Gan Y，et al.Up-regulation of PTEN(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten)mediates p38 MAPK stress signal-induced inhibition of insulin signaling〔J〕.J Biol Chem，2006;281(12):7727-36.

9 Bianco R，Shin I，Ritter CA，et al.Loss of PTEN/MMAC1/TEP in EGF receptor-expressing tumor cells counteracts the antitumor action of receptor EGFR tyrosine kinase inhibitors〔J〕.Oncogene，2003;22(18):2812-22.

10 Wu Z，Gioeli D，Conaway M，et al.Restoration of PTEN expression alters the sensitivity of prostate cancer cells to EGFR inhibitors〔J〕.Prostate，2008;68(9):935-44.

11 Kobayashi S，Boggon TJ，Dayaram T，et al.EGFR mutation and resistance of non-small cell-lung cancer to gefitinib〔J〕.N Eng JMed，2005;352(8):786-92.

12 Pao W，Miller V，Politi K，et al.Acquired resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib is associated with a second mutation in the EGFR kinase domain〔J〕.PLoSMed，2005;2(3):73.

13 Godin-Heymann N，Ulkus L，Brannigan BN，et al.The T790M''gatekeeper''mutation in EGFR mediates resistance to low concentrations of an irreversible EGFR inhibitor〔J〕.Mol Cancer Ther，2008;7(4):874-9.

14 Shimamura T，Li D，Ji H，et al.Hsp90 inhibition suppresses mutant EGFR-T790M signaling and overcomes kinase inhibitor resistance〔J〕.Cancer Res，2008;68(14):5827-38.

15 Fidler MJ，Basu S，Buckingham L，et al.Insulin-like growth factor receptor 1(IGFR-1)and outcome measures in advanced non-small cell lung cancer(NSCLC)patients treated with gefitinib〔J〕.J Clin Oncol，2008;26(15S):8036.

16 周彩存，鄧沁芳.肺癌分子靶向藥物耐藥機(jī)制的研究進(jìn)展〔J〕.中華結(jié)核和呼吸雜志，2007;3(2):138-40.

17 Engelman JA，Zejnullahu K，Mitsudomi T，et al.METamplification leads to Gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling〔J〕.Science，2007;316(5827):1039-43.

18 Engelman JA，Janne PA，Mermel C，et al.ErbB-3 mediates phospho inositide 3-kinase activity in gefitinib-sensitive nonsmall cell lung cancer cell lines〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(10):3788-93.

19 Bean J，Brennan C，Shih JY，et al.MET amplification occurs with or without T790M mutations in EGFR mutant lung tumors with acquired resistance to gefitinib or erlotinib〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2007;104(52):20932-7.

20 Yauch RL，Januario T，Eberhard DA，et al.Epithelial versus mesenchymal phenotype determines in vitro sensitivity and predicts clinical activity of erlotinib in lung cancer patients〔J〕.Clin Cancer Res，2005;11(24):8686-96.

21 Kwak EL，Sordella R，Bell DW，et al.Irreversible inhibitors of the EGF receptor may circumvent acquired resistance to gefitinib〔J〕.Proc Natl Acad Sci USA，2005;102(21):7665-70.

22 Li D，Shimamura T，Ji H，et al.Bronchial and peripheral murine lung carcinomas induced by T790M-L858R mutant EGFR respond to HKI-272 and rapamycin combination therapy〔J〕.Cancer Cell，2007;12(1):81-93.