抗氧化應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因子－Nrf2的研究進(jìn)展*

林曉萍， 李 雯， 沈華浩

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院呼吸科，浙江杭州310009)

細(xì)胞毒物、致癌物以及親電子試劑在外界環(huán)境中無處不在，這些物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物直接或間接干擾DNA、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)等生物大分子的生理功能，參與各種疾病包括腫瘤、老化、哮喘、急性肺損傷、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病和自身免疫病等疾病的病理生理過程，時刻威脅人類健康。為了對抗各種外來物質(zhì)的攻擊，細(xì)胞在進(jìn)化過程中逐漸獲得了對抗這些毒性物質(zhì)的防御能力。其中一個對抗氧化應(yīng)激最重要的細(xì)胞防御機制是由核因子E2相關(guān)因子2(nuclear factor－E2－related factor 2，Nrf2)所介導(dǎo)的，Nrf2通過與胞漿蛋白Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白－1(Kelch－like epichlorohydrin－associated protein 1，Keap1)以及抗氧化反應(yīng)元件(antioxidant response element，ARE)相互作用，啟動下游編碼抗氧化蛋白和II相解毒酶的基因表達(dá)，發(fā)揮細(xì)胞保護作用。

1 Nrf2、Keap1基本結(jié)構(gòu)

1.1 Nrf2的基本結(jié)構(gòu) Nrf2是CNC(cap'n'collar)轉(zhuǎn)錄因子家族成員中活力最強的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，主要表達(dá)于如肝臟、腎臟等代謝和解毒組織中，以及其它持續(xù)暴露在環(huán)境中的組織如皮膚、肺、消化道等，普遍表達(dá)于各種細(xì)胞［1］。

人類Nrf2與雞、鼠Nrf2具有同源性，均含有6個高度保守的環(huán)氧氯丙烷(epichlorohydrin，ECH)相關(guān)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(Nrf2－ECH homology，Neh)［1－3］。分別如下:(1)Neh1 區(qū):含 1 個 CNC 類型的堿性亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)(basic leucine zipper，bZ-ip)，必須與其它轉(zhuǎn)錄因子形成異二聚體后才能識別并結(jié)合ARE，啟動目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄。此外，該區(qū)還含有功能性核定位信號(nuclear localization signal，NLS)和富含亮氨酸的核輸出信號(nuclear export signal，NES)，參與調(diào)控Nrf2的核轉(zhuǎn)位和降解;(2)Neh2區(qū):與胞漿蛋白Keap1的Kelch區(qū)相結(jié)合;(3)Neh3:是活化轉(zhuǎn)錄所必需的，通過招募共激動劑－染色質(zhì)解螺旋酶DNA結(jié)合蛋白6(chromodomain helicase DNA－binding protein 6，CHD6)活化轉(zhuǎn)錄，不過目前還不知道CHD6的特定功能;(4)Neh4和Neh5:富含酸性氨基酸殘基，是2個獨立的激活區(qū)，二者協(xié)同激活環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白(cyclic AMP response element－binding protein，CREB)結(jié)合蛋白(CREB－binding protein，CBP);(5)Neh6區(qū):富含絲氨酸殘基，與Nrf2氧化－還原非依賴的負(fù)性調(diào)節(jié)有關(guān)，但目前尚不清楚其作用或重要性。

1.2 Keap1的基本結(jié)構(gòu) Keap1是Kelch家族多區(qū)域阻遏蛋白。正常情況下錨定于胞漿、栓在肌動蛋白細(xì)胞骨架上［2，3］。人類Keap1蛋白一級結(jié)構(gòu)包含5個區(qū)，分別是:(1)N末端區(qū)域;(2)BTB(bric－abrac/tramtrack/broad complex):是在肌動蛋白結(jié)合蛋白和鋅指轉(zhuǎn)錄因子中發(fā)現(xiàn)的一個蛋白－蛋白相互作用的進(jìn)化保守基序，通常和其它BTB區(qū)形成二聚體，是Keap1與Nrf2解離、阻止II相基因轉(zhuǎn)錄所必需的;(3)干預(yù)區(qū)(intervening region，IVR):該區(qū)域不僅富含半胱氨酸，而且含有Keap1活性最強的半胱氨酸殘基，是整個蛋白的功能調(diào)節(jié)區(qū)，不僅參與親電化合物及氧化劑的反應(yīng)，同時還參與形成泛素化連接酶、穩(wěn)定Nrf2;(4)雙甘氨酸或Kelch重復(fù)區(qū)(double glycine or Kelch repeat，DGR區(qū)):含有6個雙甘氨酸重復(fù)序列或6個Kelch模序，重復(fù)的Kelch模序形成6片經(jīng)典的β螺旋，含有多個潛在的蛋白質(zhì)結(jié)合位點，是Keap1與Neh2區(qū)結(jié)合的位點，也是Keap1與胞漿肌動蛋白結(jié)合的位點［2，3］;(5)C 末端。

2 Nrf2－Keap1系統(tǒng)活化的機制

目前認(rèn)為，Nrf2的活性主要由Keap1負(fù)性調(diào)節(jié)。在基礎(chǔ)條件下，細(xì)胞氧化－還原內(nèi)環(huán)境維持穩(wěn)定，絕大部分 Nrf2以非活性狀態(tài)儲存于細(xì)胞質(zhì)中，與Keap1相偶聯(lián)，后者與胞漿肌動蛋白結(jié)合而被錨定在胞漿，通過泛素介導(dǎo)的蛋白降解系統(tǒng)維持Nrf2的基礎(chǔ)水平;另一部分Nrf2以活性狀態(tài)存在于細(xì)胞核中介導(dǎo)基因的基本轉(zhuǎn)錄。當(dāng)受到親電子物質(zhì)或氧化劑作用時，通過細(xì)胞內(nèi)信號通道途徑，如蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)、磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol 3－kinase，PI3K)和(或)絲裂酶原激活蛋白激酶(mitogen－activated protein kinases，MAPKs)途徑，Keap1感受到氧化－還原狀態(tài)失衡，其半胱氨酸殘基被修飾，導(dǎo)致E3泛素連接酶構(gòu)象改變、不利于Nrf2泛素化，從而導(dǎo)致Nrf2發(fā)生磷酸化，與Keap1解耦聯(lián)、轉(zhuǎn)移入核，與其專性伴侶－肌腱膜纖維肉瘤蛋白(musculoaponeurotic fibrosarcoma protein，Maf)結(jié)合成異二聚體，識別并結(jié)合ARE，啟動II相解毒酶及細(xì)胞內(nèi)氧化－還原平衡蛋白基因等多種不同類型基因轉(zhuǎn)錄［2］。氧化－還原平衡一恢復(fù)，Nrf2與ARE序列解離，輸出到胞漿，通過Cullin3依賴的E3泛素連接酶機制進(jìn)行泛素化后降解，關(guān)閉Nrf2通路，重新維持低水平的Nrf2。

2.1 Nrf2與Keap1相互作用的位點 Nrf2的Neh2區(qū)存在2個不同親和力的Kelch重復(fù)區(qū)域結(jié)合位點－ETGE模序和DLG模序。反向雙雜交篩選實驗顯示鼠Neh2區(qū)的ETGE模序能夠參與Keap1 Kelch重復(fù)區(qū)的高親和力反應(yīng)［4］。Kelch重復(fù)區(qū)和含有ETGE的Neh2合作結(jié)晶學(xué)顯示Nrf2酸性肽77DEETGE82形成緊湊的β－轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)，參與多個堿性氨基酸(第380、415和483個精氨酸，第436個組氨酸)和位于鼠及人類Keap1 Kelch重復(fù)區(qū)底部的極性氨基酸(第334、525和572個酪氨酸，第363、508和555個絲氨酸，第382個天冬酰氨酸)之間的高親和力反應(yīng)。

Neh2區(qū)與Keap1第二親和力的位點，稱為DLG模序［5］。Kelch重復(fù)區(qū)的晶體學(xué)發(fā)現(xiàn)其包圍環(huán)繞著DLG模序，揭露了Nrf2的27DIDLGV32與Keap1 Kelch重復(fù)區(qū)的反應(yīng)方式和ETGE模序相似，第26個谷氨酰氨酸、第27和29個天氨酸被結(jié)合的方式與第79個谷氨酸、第80個蘇氨酸和第82個谷氨酸相似。然而，DLG肽與Kelch重復(fù)序列產(chǎn)生的相互靜電作用比ETGE肽產(chǎn)生的少。

2.2 Nrf2－Keap1系統(tǒng)活化的機制 Keap1蛋白富含活性半胱氨酸，由于位于堿性氨基酸旁邊，大約一半具有高度活性，其巰基pKa減小易于形成硫離子，與親電子劑形成復(fù)合物或者易于被氧化。在體外烷化反應(yīng)和體內(nèi)定點突變實驗均鑒定出只有保守的第151、273和 288個半胱氨酸(cysteine 151，273 and 288，C151、C273和C288)殘基是Keap1的功能亞基，缺乏這3個半胱氨酸殘基的Keap1突變體無法負(fù)性調(diào)節(jié) Nrf2［6，7］。C151 點突變?yōu)榻z氨酸的 Keap1 突變體抑制Nrf2的能力與野生型Keap1相當(dāng)，但是前者不可逆地抑制了Nrf2的活化，使ARE下游基因表達(dá)減低、氧化－還原應(yīng)激無法誘導(dǎo)，所以C151很可能是Nrf2誘導(dǎo)劑直接烷化的主要位點［6］。C273或C288點突變?yōu)榻z氨酸的Keap1突變體可以結(jié)合Nrf2，但是無法抑制Nrf2［7］。這些數(shù)據(jù)表明C151是Nrf2通路活化所必須，而C273、C288是抑制Nrf2所必須的。我們推論這3個半胱氨酸殘基可能是keap1－Nrf2感受氧化－還原狀態(tài)的中心，但具體機制有待進(jìn)一步研究。

2.3 Keap1抑制Nrf2的模型

①模型1:胞漿錨定模型 該模型認(rèn)為在正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)下，Nrf2與Keap1相互作用而停留在胞漿里。氧化應(yīng)激時，二者解偶聯(lián)，Nrf2從胞漿轉(zhuǎn)移到核內(nèi)。Keap1通過結(jié)合肌動蛋白而與細(xì)胞支架聯(lián)合在一起支持了這個模型［3］;另一種可能是Keap1通過結(jié)合磷酸變位酶家族成員5(PGAM5)與線粒體聯(lián)合［8］。因此，當(dāng)親電子試劑或氧化劑攻擊時，Nrf2可能從細(xì)胞支架或者線粒體結(jié)合部位解離。

②模型2:核－漿穿梭模型 這個模型通過氧化－還原應(yīng)激調(diào)節(jié)Nrf2。在正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)下，Keap1將Nrf2保留在1個亞核隔離區(qū)，限制Nrf2的核含量，阻止與其下游基因啟動子ARE序列結(jié)合;應(yīng)激狀態(tài)下，核蛋白前胸腺素結(jié)合Keap1的Kelch重復(fù)區(qū)域，從而釋放Nrf2，激活其下游基因［9］。Nrf2的核定位信號(NLS)和核輸出信號(NES)之間的平衡調(diào)節(jié)Nrf2在細(xì)胞中的穿梭運動以及Nrf2的降解。輸出蛋白Crm－1可與Nrf2的NES結(jié)合，調(diào)控Nrf2進(jìn)行核輸出和降解。位于Neh5區(qū)內(nèi)的NES有一個內(nèi)源性半胱氨酸，由氧化劑或親電子試劑修飾后，可阻止識別輸出蛋白Crm－1的模序，導(dǎo)致Nrf2核堆積;bZIP區(qū)內(nèi)的NES緊鄰第568個酪氨酸，在氧化應(yīng)激期間，該酪氨酸發(fā)生磷酸化，可能阻止輸出蛋白Crm－1介導(dǎo)的Nrf2核輸出［2］。也有研究認(rèn)為糖原合成酶激酶－3(glycogen synthase kinase 3，GSK －3)參與Nrf2的穿梭運動。GSK－3屬于保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶家族，包括GSK－3α(51 kD)和 GSK －3β(47 kD)2種亞型，目前研究主要集中在GSK－3β。GSK－3β具有廣泛的細(xì)胞功能，參與細(xì)胞凋亡、新陳代謝、蛋白質(zhì)翻譯及基因表達(dá);還介導(dǎo)Nrf2磷酸化、抑制其核轉(zhuǎn)位［10］。

③模型3:泛素化降解模型 這個模型說明在正常內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)下，在Keap1依賴的形式下，Nrf2不斷被26S蛋白酶體降解。2004年，已證明Keap1是負(fù)責(zé)Nrf2降解的Keap1－Cullin3－Rbx1 E3泛素連接酶復(fù)合體的底物銜接蛋白［11］。在基礎(chǔ)條件下，Keap1通過其 BTB區(qū)結(jié)合 Cullin3、Kelch區(qū)結(jié)合 Nrf2，將Nrf2連接到E3復(fù)合體，使泛素從E3轉(zhuǎn)移到Nrf2的賴氨酸殘基;同時，Cullin3結(jié)合ring－box1(Rbx1，也稱為Roc1)，形成一個核心E3泛素連接酶復(fù)合體。從而，泛素化的Nrf2很快由26S蛋白酶體降解而保持Nrf2通路關(guān)閉。

④模型4:Nrf2基因誘導(dǎo)模型 Nrf2基因啟動子包含ARE序列和異源物質(zhì)反應(yīng)元件(xenobiotic responsive element，XREs)。ARE序列對一些具有抗氧化能力的外來物反應(yīng)，XRE則由轉(zhuǎn)錄因子芳香烴受體(aryl hydrocarbon receptor，AhR)激活，主要調(diào)節(jié) I相代謝酶表達(dá)。3H－1，2－二硫雜環(huán)戊二烯－3－硫酮和萊菔硫烷處理后，鼠角質(zhì)化細(xì)胞的Nrf2 mRNA水平增高［12］，表明Nrf2基因啟動子中含有ARE序列;2，3，7，8－四氯二苯二氧芑處理后，肝癌1c1c7細(xì)胞的Nrf2蛋白和mRNA含量均增加，這與Nrf2基因啟動子存在 XREs相一致［2］。

由于這些機制可能在不同的生理狀態(tài)下執(zhí)行，所以這4個模型不相互排斥，可以獨立存在，亦可相互補充。

3 Nrf2的功能

Nrf2介導(dǎo)的抗氧化反應(yīng)是一種主要的細(xì)胞防御機制。Nrf2缺失或激活障礙，可加重氧化應(yīng)激源的細(xì)胞毒性，導(dǎo)致細(xì)胞功能障礙、凋亡甚至死亡。在過去20年里，有關(guān)Nrf2、氧化應(yīng)激與人類不同疾病發(fā)病機理關(guān)系的研究增多，這些疾病包括:腫瘤、哮喘等呼吸系統(tǒng)疾病、動脈粥樣硬化、神經(jīng)退行性疾病和老化過程。

3.1 Nrf2活化預(yù)防和促進(jìn)腫瘤

①Nrf2活化預(yù)防腫瘤作用 50多年的研究鑒定出許多來源于植物的化合物－植物化學(xué)物質(zhì)，具有化學(xué)預(yù)防功能;同時也已鑒定出許多化學(xué)預(yù)防化合物是Nrf2的誘導(dǎo)劑。植物來源的強Nrf2誘導(dǎo)劑包括:萊菔硫烷(十字花科蔬菜)、姜黃素(香料)、表兒茶素酸酯(綠茶)、白藜蘆醇(葡萄)、咖啡酸苯乙酯(松樹)、咖啡醇和咖啡白(咖啡)、番茄紅素(番茄)。除了植物化學(xué)物質(zhì)外，有些合成的化學(xué)藥品如奧替普拉也是強Nrf2誘導(dǎo)劑。這些化學(xué)預(yù)防復(fù)合物通過誘導(dǎo)Nrf2依賴的適應(yīng)性反應(yīng)，包括II相解毒酶、抗氧化劑和防止細(xì)胞隨后發(fā)展成腫瘤的運載體，發(fā)揮其化學(xué)預(yù)防功能。因此，認(rèn)為Nrf是一個“好”蛋白，保護人類免受致癌物質(zhì)所致的遺傳損傷。

許多使用Nrf2敲除小鼠的體內(nèi)研究進(jìn)一步證明了Nrf2在腫瘤預(yù)防中的關(guān)鍵作用。Nrf2敲除小鼠的II相基因如谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(glutathione S－transferase，GST)、還原型輔酶Ⅰ醌類氧化還原酶［NAD(P)H:quinone oxidoreductase 1，NQO1］和谷氨酰半胱氨酸連接酶(glutamate－cysteine ligase，GCL)的基礎(chǔ)和誘導(dǎo)水平均減少。Nrf2敲除小鼠對化學(xué)毒物和致癌物質(zhì)的敏感性增高，對腫瘤預(yù)防復(fù)合物的保護作用產(chǎn)生抵抗。

②Nrf2促進(jìn)腫瘤 令大家驚奇的是，新的研究揭示出Nrf2也有“陰暗面”，它不僅能阻止正常細(xì)胞轉(zhuǎn)化成腫瘤細(xì)胞，但在有害環(huán)境中也能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長。腫瘤細(xì)胞系或者腫瘤組織通過Keap1突變或基因雜合性丟失，上調(diào)Nrf2蛋白水平及其下游基因的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)腫瘤的生長。人體研究也表明，肺腺癌患者有高Keap1體細(xì)胞突變發(fā)生率;在乳腺癌患者中發(fā)現(xiàn)Keap1第23個半胱氨酸點突變損害了Keap1抑制Nrf2轉(zhuǎn)錄的功能，雖然其仍能與Nrf2和Cullin3相互作用，但無法有效地促進(jìn) Nrf2泛素化［13］。綜上所見，Keap1功能喪失可能會導(dǎo)致Nrf2長期活化，上調(diào)Nrf2下游基因從而給癌細(xì)胞提供生長幫助。

另外，Nrf2誘導(dǎo)化學(xué)耐藥也可能是促進(jìn)腫瘤生長的機制。Nrf2穩(wěn)定過表達(dá)能增強腫瘤細(xì)胞對順鉑、阿霉素和足葉乙甙等化療藥的耐藥性，相反，使用小干擾 RNA(small interfering RNA，siRNA)干擾Nrf2后，能增加腫瘤細(xì)胞對這些化療藥物的敏感性。同樣，應(yīng)用小分子化學(xué)藥物－特丁基對苯二酚(tertiary butylhydroquinone，tBHQ)激活Nrf2也能增強腫瘤細(xì)胞對化療藥物的耐藥性［14］。

3.2 Nrf2在氣道疾病中的保護作用 整個支氣管氣道上皮細(xì)胞襯液和組織中含有豐富的胞內(nèi)、胞外抗氧化劑。由于氣道首先與吸入性氧化劑接觸，其氧化－還原平衡可被增強的氧化負(fù)擔(dān)反復(fù)打亂。已知許多急、慢性呼吸系統(tǒng)疾病的發(fā)病機理與氧化應(yīng)激有關(guān)，包括肺氣腫/慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、哮喘、急性肺損傷(acute lung injury，ALI)/急性呼吸窘迫綜合征(acute respiratory distress syndrome，ARDS)、肺惡性腫瘤、特發(fā)性肺纖維化和囊性纖維化。

①肺氣腫/慢性阻塞性肺疾病(COPD) 多個人類研究表明，老年吸煙者和COPD患者中肺組織和肺泡巨噬細(xì)胞中Nrf2－Keap1－Bach1平衡低下，Bach1和Keap1水平增高。相比Nrf2+/+小鼠，長期暴露于香煙煙霧(4或6個月)的Nrf2－/－小鼠，將導(dǎo)致更嚴(yán)重的肺氣腫癥狀、氧化DNA加合物形成增多、細(xì)胞凋亡并抑制肺抗氧化酶［15］。

②哮喘和過敏性氣道疾病 動物實驗研究表明，Nrf2缺陷使卵白蛋白誘發(fā)的氣道炎癥和高反應(yīng)性增強;Nrf2－/－小鼠還同時伴隨顯著的肺黏液細(xì)胞過度增生、嗜酸性細(xì)胞浸潤、Th2細(xì)胞因子IL－4和IL－13增多以及體內(nèi)多種抗氧化劑功能受抑制。暴露于環(huán)境中各種氧化劑，例如臭氧或汽車尾氣顆粒(diesel exhaust particle，DEP)等顆粒物質(zhì)，能引起哮喘樣癥狀或者加重原有氣道變應(yīng)性疾病。DEP包含許多前氧化劑和醌、多環(huán)芳烴等致癌物質(zhì)，能夠誘導(dǎo)肺泡巨噬細(xì)胞和支氣管上皮細(xì)胞1型血紅素氧化酶(heme oxygenase 1，HO－1)、GST和其它 II相酶表達(dá)。研究已經(jīng)闡述了Nrf2－ARE信號通路在DEP誘導(dǎo)的肺氧化應(yīng)激和損傷中的重要性。他們發(fā)現(xiàn)暴露于大劑量 DEP(3 mg/m3)后，Nrf2－/－小鼠形成的DNA加合物比Nrf2+/+小鼠明顯增多;暴露于低劑量DEP(100 μg/m3)后，Nrf2－/－小鼠氣道高反應(yīng)性以及淋巴細(xì)胞和嗜酸性細(xì)胞的炎癥顯著增強［16］。總的來說，Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路可決定對不同過敏原引起肺部疾病的敏感性。

③ ALI/ARDS Cho 等［17］通過對比 Nrf2+/+和Nrf2－/－小鼠對組織高氧的不同反應(yīng)來證明Nrf2是ALI模型中一個候選易感基因。相比野生型小鼠，Nrf2－/－小鼠肺高通透性、炎癥浸潤和上皮損傷增強;與Nrf2－ARE通路在高氧引起的肺毒性中的保護作用一致，Nrf2－DNA結(jié)合活性和多種抗氧化酶(如GST、NQO1、GCL、HO － 1)的表達(dá)在 Nrf2－/－小鼠中明顯減弱。在高潮氣量機械通氣引起的呼吸機相關(guān)性肺損傷(ventilator－induced lung injury，VILI)小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，與Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺泡和血管通透性以及VILI相關(guān)的前炎癥因子水平升高，ARE反應(yīng)性谷胱甘肽合成酶水平減少，氧化－還原平衡破壞［18］。調(diào)查人員還發(fā)現(xiàn)小鼠Nrf2在實驗性顱腦損傷所致的ALI中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。通過中度體重下降誘發(fā)小鼠腦損傷，與 Nrf2+/+小鼠相比，Nrf2－/－小鼠肺毛細(xì)血管通透性、濕/干重比和肺泡細(xì)胞凋亡加劇;肺損傷加重與炎癥因子(TNF－α、IL－1β、IL－6)表達(dá)增多和肺抗氧化和解毒酶(NQO1、GST)減少有關(guān)［19］。

④彌漫間質(zhì)性肺纖維化 Nrf2介導(dǎo)的抗氧化通路是限制博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化所必須的。已經(jīng)闡明了ARE下游的抗氧化酶在實驗性纖維化中的保護作用。通過給予多酚表兒茶素酸酯活化Nrf2－ARE反應(yīng)可以減輕博來霉素誘導(dǎo)的大鼠肺損傷和炎癥［20］。盡管沒有明確的證據(jù)證明Nrf2在人纖維化患者中的作用，但是觀察到IPF患者肺中Nrf2表達(dá)伴隨著氧化劑標(biāo)記增多，這說明二者是有關(guān)聯(lián)的。

3.3 Nrf2參與動脈粥樣硬化 氧化應(yīng)激和炎癥是促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊形成的2個關(guān)鍵因素。Dai等［21］使用siRNA技術(shù)抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞Nrf2表達(dá)，同時聯(lián)合全基因組轉(zhuǎn)錄譜，確定Nrf2是改變血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化－還原平衡的一個關(guān)鍵性決定因素。在2種標(biāo)準(zhǔn)動脈切應(yīng)力下培養(yǎng)人血管內(nèi)皮細(xì)胞，并從經(jīng)典的動脈粥樣硬化模型2個不同血管區(qū)域－“易感”區(qū)和“耐受”區(qū)中分離出動脈粥樣硬化保護劑－氯貝丁酯，從而證明“動脈粥樣硬化保護”流通過磷酸酰肌醇激酶(PI3K)/Akt通路差異激活小鼠主動脈粥樣硬化“耐受”區(qū)和“易感”區(qū)的Nrf2及其下游轉(zhuǎn)錄因子，來維持血管內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)氧化－還原平衡、減輕氧化應(yīng)激所致的損傷。

但是，Sussan 等［22］將 Nrf2－/－小鼠與載脂蛋白 E缺陷 (ApoE－/－)小鼠雜交，同時予 ApoE－/－和ApoE－/－Nrf2－/－小鼠致動脈粥樣硬化的飲食 20周，最終在主動脈形成粥樣硬化斑塊。與ApoE－/－小鼠相比，ApoE－/－Nrf2－/－小鼠形成的斑塊面積明顯減小(29.5% 比 11.5%)，而且，斑塊面積減少與ApoE－/－Nrf2－/－小鼠巨噬細(xì)胞攝取修飾后低密度脂蛋白的量顯著減少有關(guān);后來，從 ApoE－/－Nrf2－/－小鼠分離的巨噬細(xì)胞和動脈粥樣硬化斑塊中發(fā)現(xiàn)清道夫受體－分化抗原簇36(cluster of differentiation 36，CD36)表達(dá)減少。以上表明，盡管Nrf2有抗氧化功能，但其在小鼠體內(nèi)是一個促動脈粥樣硬化劑，這個促進(jìn)作用可能通過陽性調(diào)節(jié)CD36分子介導(dǎo)。總之，Nrf2在動脈粥樣硬化中的作用仍需進(jìn)一步研究，以幫助制定有利于預(yù)防動脈粥樣硬化斑塊形成的治療策略。

再者，活化的Nrf2也可抑制血管平滑肌細(xì)胞增殖;保護缺血－再灌注損傷對心肌細(xì)胞的損害。

3.4 Nrf2對急性神經(jīng)損傷、神經(jīng)退行性變、大腦缺血等有保護作用 體內(nèi)外模型均顯示Nrf2－ARE通路能有效阻斷由于谷胱甘肽消耗、脂質(zhì)過氧化、胞內(nèi)鈣超載、神經(jīng)興奮性毒素和線粒體電子傳遞鏈斷裂而致的神經(jīng)毒性，而且還能增加神經(jīng)元能量和氧化－還原電位、抑制性神經(jīng)遞質(zhì)信號和代謝過程。星形膠質(zhì)細(xì)胞－運動神經(jīng)元共培養(yǎng)實驗數(shù)據(jù)表明星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌的谷胱甘肽是Nrf2活化后產(chǎn)生神經(jīng)保護作用的一個主要組成部分，它由谷氨酸－半胱氨酸連接酶(GCL)和谷胱甘肽合成酶(GSH)連續(xù)作用合成，GCL催化亞基(glutamate cysteine ligase catalytic subunits，GCLC)和修飾亞基(glutamate cysteine ligase modulatory subunits，GCLM)組成了 GSH合成的限速酶復(fù)合物，Nrf2活化后GCLC和GCLM的表達(dá)均增多。與神經(jīng)元相比，星形膠質(zhì)細(xì)胞中優(yōu)先活化的Nrf2使GSH合成更有效、含量更高，其分泌的GSH通過作為細(xì)胞外抗氧化劑和/或通過增加GSH合成前體利用率提高神經(jīng)元GSH水平來保護神經(jīng)元［23］。

此外，轉(zhuǎn)錄因子Nrf2還與炎癥、自身免疫性疾病、糖尿病、慢性腎功能衰竭等其它人類疾病的發(fā)病、預(yù)防有關(guān)。

總之，普遍表達(dá)于各種細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子Nrf2介導(dǎo)的細(xì)胞防御機制在對抗各種環(huán)境應(yīng)激和內(nèi)源性應(yīng)激的反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，是參與腫瘤預(yù)防、腫瘤耐藥、哮喘、COPD、神經(jīng)和血管保護的重要效應(yīng)分子。因此，我們應(yīng)深入研究 Nrf2，闡明 Nrf2－Keap1－ARE通路對不同氧化應(yīng)激反應(yīng)的確切調(diào)控機制，闡明功能受損的Nrf2－Keap1系統(tǒng)與人類不同疾病之間的相關(guān)性，利用該通路作為疾病預(yù)防控制以及治療策略的靶點，為人類健康造福。

［1］Moi P，Chan K，Asunis I，et al.Isolation of NF －E2 －related factor 2(Nrf2)，a NF－E2－like basic leucine zipper transcriptional activator that binds to the tandem NFE2/AP1 repeat of the β － globin locus control region［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1994，91(21):9926 －9930.

［2］Zhang DD.Mechanistic studies of the Nrf2－Keap1 signaling pathway［J］.Drug Metab Rev，2006，38(4):769 －789.

［3］Kang MI，Kobayashi A，Wakabayashi N，et al.Scaffolding of Keap1 to the actin cytoskeleton controls the function of Nrf2 as key regulator of cytoprotective phase 2 genes［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(7):2046 －2051.

［4］Kobayashi M，Itoh K，Suzuki T，et al.Identification of the interactive interface and phylogenic conservation of the Nrf2 － Keap1 system［J］.Genes Cells，2002，7(8):807 －820.

［5］McMahon M，Thomas N，Itoh K，et al.Dimerization of substrate adaptors can facilitate cullin－mediated ubiquitylation of proteins by a“tethering”mechanism:a two－site interaction model for the Nrf2 －Keap1 complex［J］.J Biol Chem，2006，281(34):24756 －24768.

［6］Luo Y，Eggler AL，Liu D，et al.Sites of alkylation of human Keap1 by natural chemoprevention agents［J］.J Am Soc Mass Spectrom，2007，18(12):2226 －2232.

［7］Zhang DD，Hannink M.Distinct cysteine residues in Keap1 are required for Keap1－dependent ubiquitination of Nrf2 and for stabilization of Nrf2 by chemopreventive agents and oxidative stress［J］.Mol Cell Biol，2003，23(22):8137－8151.

［8］Lo SC，Hannink M.PGAM5 tethers a ternary complex containing Keap1 and Nrf2 to mitochondria［J］.Exp Cell Res，2008，314(8):1789 －1803.

［9］Karapetian RN，Evstafieva AG，Abaeva IS，et al.Nuclear oncoprotein prothymosin α is a partner of Keap1:implications for expression of oxidative stress－protecting genes［J］.Mol Cell Biol，2005，25(3):1089 －1099.

［10］Salazar M，Rojo AI，Velaseo D，et al.Glycogen synthase kinase－3β inhibits the xenobiotic and antioxidant cell response by direct phosphorylation and nuclear exclusion of the transcription factor Nrf2［J］.J Biol Chem，2006，281(21):14841－14851.

［11］Cullinan SB，Gordan JD，Jin J，et al.The Keap1 － BTB protein is an adaptor that bridges Nrf2 to a Cul3－based E3 ligase:oxidative stress sensing by a Cul3－Keap1 ligase［J］.Mol Cell Biol，2004，24(19):8477 － 8486.

［12］Kwak MK，Itoh K，Yamamoto M，et al.Enhanced expression of the transcription factor Nrf2 by cancer chemopreventive agents:role of antioxidant response element－like sequences in the Nrf2 promoter［J］.Mol Cell Biol，2002，22(9):2883－2892.

［13］Nioi P，Nguyen T.A mutation of Keap1 found in breast cancer impairs its ability to repress Nrf2 activity［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，362(4):816 －821.

［14］Wang XJ，Sun Z，Villeneuve NF，et al.Nrf2 enhances resistance of cancer cells to chemotherapeutic drugs，the dark side of Nrf2［J］.Carcinogenesis，2008，29(6):1235－1243.

［15］Malhotra D，Thimmulappa R，Navas － Acien A，et al.Dcline in NRF2－regulated antioxidants in chronic obstructive pulmonary disease lungs due to loss of its positive regulator，DJ－1［J］.Am J Respir Crit Care Med，2008，178(6):592－604.

［16］Li YJ，Takizawa H，Azuma A，et al.Disruption of Nrf2 enhances susceptibility to airway inflammatory responses induced by low － dose diesel exhaust particles in mice［J］.Clin Immunol，2008，128(3):366 －373.

［17］Cho HY，Jedlicka AE，Reddy SP，et al.Role of NRF2 in protection against hyperoxic lung injury in mice［J］.Am J Respir Cell Mol Biol，2002，26(2):175 －182.

［18］Papaiahgari S，Yerrapureddy A，Reddy SR，et al.Genetic and pharmacologic evidence links oxidative stress to ventilator－ induced lung injury in mice［J］.Am J Respir Crit Care Med，2007，176(12):1222 －1235.

［19］Jin W，Wang H，Yan W，et al.Role of Nrf2 in protection against traumatic brain injury in mice［J］.J Neurotrauma，2009，26(1):131 －139.

［20］Sriram N，Kalayarasan S，Sudhandiran G.Epigallocatechin－3－gallate augments antioxidant activities and inhibits inflammation during bleomycin－induced experimental pulmonary fibrosis through Nrf2 － Keap1 signaling［J］.Pulm Pharmacol Ther，2009，22(3):221 －236.

［21］Dai G，Vaughn S，Zhang Y，et al.Biomechanical forces in atherosclerosis－resistant vascular regions regulate endothelial redox balance via phosphoinositol 3－kinase/Aktdependent activation of Nrf2［J］.Circ Res，2007，101(7):723－733.

［22］Sussan TE，Jun J，Thimmulappa R，et al.Disruption of Nrf2，a key inducer of antioxidant defenses，attenuates ApoE － mediated atherosclerosis in mice［J］.PloS One，2008，3(11):e3791.

［23］Kraft AD，Johnson DA，Johnson JA.Nuclear factor E2 －related factor 2－dependent antioxidant response element activation by tert－butylhydroquinone and sulforaphane occurring preferentially in astrocytes conditions neurons against oxidative insult［J］.J Neurosci，2004，24(5):1101－1112.