Cyt-C與caspase在細胞凋亡中的作用及相互關系

朱炎杰 高維娟 (承德醫(yī)學院病理生理學教研室，河北 承德 067000)

細胞凋亡，又稱細胞程序性死亡，是指細胞在一定的生理或病理性條件下，遵循自身的程序，自己結束其生命的過程，是一種主動的、程序性的、細胞固有的生物學過程，其特征是一系列細胞形態(tài)學的改變，包括染色體濃縮、核碎裂、細胞皺縮、凋亡小體形成等〔1，2〕。近年研究發(fā)現(xiàn)，腦缺血再灌注致神經細胞死亡主要由凋亡所致〔3，4〕，細胞色素C(Cyt-C)和天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶(caspase)家族在細胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展中起著關鍵作用〔5〕。近年來對兩種酶與各種疾病以及兩種酶與凋亡的研究逐漸增加，本文將就此作出綜述，同時探討二者在細胞凋亡中的關系。

1 Cyt-C與細胞凋亡

1.1 Cyt-C概述 Cyt-C是一種水溶性蛋白，由核基因編碼，分子量為12～13 kD，位于線粒體內膜的外側，呼吸鏈復合體Ⅲ～Ⅳ之間，Cyt-C是線粒體呼吸鏈(MRC)中傳遞電子的載體。對線粒體能量代謝起重要的調節(jié)作用〔6〕。

無活性前體分子在胞漿內合成的前Cyt-C是一種核基因編碼的水溶性蛋白，其相對分子質量為12～13 kD。電子在轉運的過程中，伴隨著質子從基質被泵到線粒體膜間隙，從而建立線粒體跨膜電位(ΔΦm)。當質子從線粒體膜間隙反流回基質中，使另一個蛋白復合分子FOF1-ATP酶(或復合物Ⅴ)產生ATP。所有這些過程必須有序地進行。如果Cyt-C缺失或其功能障礙將會導致線粒體呼吸鏈出現(xiàn)功能異常，結果ATP缺乏，使細胞死亡。在細胞凋亡過程中Cyt-C釋放進入胞質，與凋亡活化因子1(Apaf-1)結合，Apaf-1與線蟲的Ced-4相似，它的氨基端由caspase循環(huán)結構域組成，羧基端有12個WD-40重復區(qū)，中間320個氨基酸殘基則與Ced-4有22%的同源，48%的相似性。Cyt-C可與Apaf-1的羧基端結合，通過Apaf-1的氨基端再與procaspase-9的功能前區(qū)相互作用，形成相對分子質量為 700 ×103～1 400 ×103的巨大復合物〔7～9〕，自發(fā)激活caspase-9。Cyt-C/Apaf-1/caspase-9復合物即謂凋亡體，凋亡體內活化的caspase-9作為蛋白酶激活下游的caspase家族如caspase-3、easpase-7。其中caspase-3是主要的凋亡效應蛋白，它可激活CAD及ACINUS，繼而引起細胞核濃縮及DNA裂解，使細胞發(fā)生凋亡〔10〕。研究表明，在凋亡初期，Cyt-C從線粒體內膜釋放，啟動細胞的凋亡機制。

1.2 Cyt-C在線粒體中的釋放機制 目前Cyt-C釋放的機制主要有兩種〔11，12〕:一是線粒體外膜蛋白聚合形成膜通透轉運孔(PTP)復合體，導致外膜非特異性斷裂〔13〕;二是促凋亡基因Bax的誘導作用，引發(fā)了細胞的凋亡。但抗凋亡基因Bcl-2可以阻斷Cyt-C的釋放和caspase的活化;Bcl-2家族蛋白如Bcl-2、Bcl-xL和Bax具有成孔性質，估計它們直接調節(jié)線粒體膜對Cyt-C的通透性〔14，15〕。Cyt-C的釋放是細胞死亡程序中關鍵的一步。一種類似白細胞介素1B轉換酶的caspase的激活是Fas和腫瘤壞死因子僅受體信號途徑的早期過程。該酶的抑制阻止了Cyt-C從線粒體中釋放，也抑制了Fas介導的細胞凋亡。但至今還未證實caspase與線粒體膜的主要成分直接反應。在很多細胞凋亡實驗中，caspase抑制劑并不能導致Cyt-C的釋放。由此可見，線粒體向胞質釋放一些凋亡相關因子，啟動凋亡反應，其中最重要的是Cyt-C。

1.3 Cyt-C在細胞凋亡中的作用 線粒體Cyt-C是凋亡發(fā)生的閥門，能通過調節(jié)細胞能量代謝決定細胞死亡方式。細胞受刺激后發(fā)生凋亡還是壞死，很大程度上取決于細胞內ATP水平。如Cyt-C釋放后，細胞內ATP仍能維持適當水平，則釋放到胞漿的Cyt-C可通過激活caspase來介導細胞凋亡;如釋放后細胞內ATP不能維持適當?shù)乃?，則細胞發(fā)生壞死。Cyt-C在凋亡中的作用，最初是在以胞漿抽提體系對凋亡研究時發(fā)現(xiàn)的，即核凋亡(DNA片段化)依賴于某種細胞器碎片存在，隨后證實這種細胞器碎片的成分是Cyt-C。進一步研究發(fā)現(xiàn)，線粒體釋放到胞漿的Cyt-C可通過與apaf-1結合，招募caspase-9聚集，激活 Procaspase;在 dATP存在時，caspase-9可直接活化caspase-3，介導細胞凋亡〔16〕。

Cyt-C可通過對凋亡信號的傳導和放大作用調控細胞凋亡，此作用正在被逐漸闡明。凋亡信號傳導有三條基本途徑:第一條是由膜受體(如 FasL)介導，激活 caspase-8，再激活caspase-3，介導細胞凋亡。除直接活化caspase-3外，在Ⅱ型細胞(如肝細胞)，caspase-8還能通過裂解胞漿蛋白p22 Bid;引起線粒體細胞色素C釋放，并激活caspase-9、再活化caspase3，介導細胞凋亡。Ⅰ型細胞沒有這條分支，Bcl-2對膜受體介導的Ⅰ型細胞凋亡無保護作用。有研究報道〔17，18〕，caspase-8直接活化caspase-3的能力與活化的caspase-8的量有關，Cyt-C能放大這種效應，確保收到凋亡信號的細胞發(fā)生凋亡。在某些細胞類型，由caspase-8直接活化的caspase-3在凋亡過程中可能不起主要作用。如在TNF-α誘導L929細胞凋亡實驗中發(fā)現(xiàn)，盡管caspase-8可以直接激活caspase-3，但這并不是caspase-3激活的主要方式，因為caspase-8抑制劑對細胞存活率和caspase-3活性沒有影響，而抑制Cyt-C釋放不僅可明顯降低 caspase-3活性，而且顯著提高細胞存活率，提示線粒體釋放Cyt-C途徑是caspase-3活化的主要方式。第二條是由線粒體膜功能紊亂或損傷介導，各種凋亡誘導劑超載作用于線粒體，引起線粒體Cyt-C釋放，激活 caspase-9、再活化 caspase-3、-7，介導細胞凋亡。第三條途徑，即內質網(wǎng)應激，引起內質網(wǎng)鈣釋放，導致胞漿內鈣穩(wěn)態(tài)失衡，激活caspase-12，介導細胞凋亡。此外，Cyt-C釋放還可通過引起線粒體呼吸鏈電子傳遞障礙，使活性氧(RoS)產生增加，介導細胞凋亡〔19〕。

2 caspase與細胞凋亡

2.1 caspase家族概述 caspase全稱為天冬氨酸特異性的半胱氨酸蛋白水解酶〔20〕。caspase是一組存在于細胞質中具有類似結構的蛋白酶。它們的活性位點均包含半胱氨酸殘基，能夠特異性的切割靶蛋白天冬氨酸殘基后的肽鍵。caspase負責選擇性的切割某些蛋白質，從而造成細胞凋亡。caspase蛋白族的分類從1992年人類第1次純化caspase-l并測序其cDNA，迄今為止已發(fā)現(xiàn)哺乳動物至少有14種caspase蛋白酶家族成員。根據(jù)caspase之間大小亞單位序列的同源性以及功能，可分為3組:①細胞因子處理組:caspase-l、-4、-5、-11、-12、-13、-14;②凋亡起始組Caspase-2、-8、-9和-10;③凋亡效應組caspase-3、-6和-7。caspase在細胞內合成和分泌。酶原含有3個結構域，一個NH2-端結構域，一個大的亞單位(相對分子質量約20×103)和一個小的亞單位(相對分子質量約10×103)。

所有的成員都保守性地包含有與底物P1Asp作用的氨基酸殘基，如在ICE中，它們是催化中心的Cys285，與酶/抑制劑復合物的巰基半縮醛以氫鍵結合的His237，以及可以穩(wěn)定反應中間物氧陰離子的 Gly238。另外，Arg179、Arg341、Gln383和 Ser347形成容納P1Asp的“口袋”，Ser339靠近Cys285的巰基，以氫鍵結合P1位的酰胺。與P2～P4作用的氨基酸殘基則變異比較大，這可能是各個成員識別不同底物的特異性之所在。在活性Cys周圍的氨基酸序列也很保守，一般都有 Gln-Ala-Cys-Arg-Gly(QACRG)五肽序列，在 caspase-8、caspase-10中為 QACQG，在caspase-9中是QACGG，這三個成員都有一個氨基酸殘基的變異，但這種變異不影響蛋白酶的剪切活性和特異性。

2.2 caspase的活化 未活化的caspase家族蛋白酶是以酶原形式存在的，酶原的氨基端有一段被稱為“原結構域”(pro-domain)的序列。酶原活化時不但要將原結構域切除，并且要將剩余部分剪切成一大一小兩個亞基，分別稱為P20和P10，活性酶就是由這兩種亞基以(P20/P10)2的形式組成的。這種活化反應也是Asp特異的，剪切發(fā)生在酶原中保守序列的Asp與其后的氨基酸殘基之間，一般是先切下羧基端的小亞基，然后再從大亞基的氨基端切去原結構域。這種剪切可以是酶原及中間活性酶自我催化，也可以是其他ICE家族蛋白酶的作用，還有其他酶類如顆粒酶B參與。

caspase蛋白酶在死亡受體介導的細胞凋亡中起著中心的作用〔21〕。Fas與配體結合而活化后，首先引起YVAD和zVAD敏感的ICE家族蛋白酶活化，然后再活化DEVD敏感的蛋白酶。其中caspase-8是這一凋亡過程中首先被活化的ICE家族蛋白酶。caspase-8活化后，一方面它可以剪切活化caspase-3、caspase-7、caspase-4、caspase-9 和 caspase-10，通過這些蛋白酶剪切底物使凋亡得以進行;另一方面，它的活性可以被CrmA所抑制，籍此可作為細胞凋亡負調控因素作用的環(huán)節(jié)。

caspase-8的活化可以是Fas與其配體結合引起的FADD蛋白與caspase-8結合的結果，也可能是顆粒酶B、ICE等作用的結果。所以其他能夠引起細胞凋亡的因素也可以通過激活顆粒酶B或ICE來激活凋亡信號轉導途徑。caspase-8活化后引起caspase-3和caspase-7活化，這兩種酶都可以剪切PARP，引起DNA的降解。另外caspase-3還可以活化caspase-6，后者可以降解層蛋白B。此外，U1核糖體蛋白的70 kD亞基(U1-70K)、DNA依賴的蛋白(DNA-PK)的催化亞基、微絲相關蛋白Gas-2、-actin、PKC、視網(wǎng)膜母細胞瘤蛋白、DNA拓撲異構酶Ⅰ和Ⅱ等也都可能作為caspase-3和caspase-6的作用底物。在哺乳動物細胞的凋亡過程中caspase-3、-6、-7是與CED-3最相似的蛋白酶，它們完成了大部分剪切底物的作用，發(fā)揮了CED-3在美麗線蟲中發(fā)揮的作用。

2.3 caspase在細胞凋亡中的作用 caspase在凋亡的執(zhí)行過程中以一種很有程序的方式對細胞進行解體。它們切斷凋亡細胞與周圍細胞的聯(lián)系，關閉DNA的復制與修復，阻斷RNA的剪接，降解DNA，破壞核的結構，誘導細胞向外發(fā)出信號以便被周圍的細胞吞噬，最后將細胞解體并包裹形成凋亡小體。

目前與caspase有關的凋亡通路至少有3種〔22〕:Cyt-C通路、死亡受體通路和內質網(wǎng)通路。caspase凋亡的所有途徑最終都是激活caspase-3而導致細胞凋亡，因此caspase-3被認為是各種凋亡刺激因子激活的caspase家族中的關鍵蛋白酶〔23〕。但要使下游的caspase-3激活，除了它的自我激活和非caspase蛋白酶活化外，起始caspase的轉活化也是很重要的。caspase-3是凋亡啟動蛋白，在caspases家族中起關鍵作用，caspase-9是caspase-3的上游調控蛋白，caspase-9的活化能激活caspase-3而使細胞發(fā)生凋亡。研究證明〔24〕，Apaf-3就是caspase-9，在生物體內的心臟，睪丸和卵巢具有高水平的mRNA表達，在dATP存在的條件下通過Apaf-1和Cyt-C可以直接激活caspase-9。caspase-9 是個多功能的分子，間接活化 caspase-2、-6、-8、-10，直接活化 caspase-3、-7。

3 Cyt-C與caspase在細胞凋亡中的相互關系

線粒體Cyt-C與caspase之間關系密切。正常情況下caspase以無活性酶原形式存在于活細胞中，當收到凋亡誘導信號刺激時，通過對其內部門冬氨酸殘基位點的蛋白水解而激活。一旦caspase激活，將引發(fā)caspase級聯(lián)反應，通過裂解特異性底物及激活內源性核酸酶，使凋亡細胞呈現(xiàn)典型的形態(tài)學和生物化學特征。線粒體釋放到胞漿中的Cyt-C可通過與Apaf-1結合，活化caspase-9，啟動caspase級聯(lián)反應介導細胞凋亡;而活化的caspase可通過對胞漿底物的裂解促進線粒體Cyt-C釋放，如 caspase-8能通過對 Bcl-2家族促凋亡蛋白p22Bid的裂解，促進線粒體 Cyt-C釋放，caspase-3、-6、-7不能裂解p22Bid，但可通過對其他胞漿底物的裂解，啟動線粒體Cyt-C釋放。資料提示:caspase可對胞漿底物裂解啟動Cyt-C釋放，在凋亡過程中具有放大caspase瀑布效應及促進細胞凋亡的作用〔25，26〕。

4 結語

Cyt-C具有調控細胞能量代謝和凋亡的雙重功能。通過調節(jié)細胞能量代謝，Cyt-C可調控細胞死亡方式，通過對凋亡信號的傳導和放大作用及引起ROS產生增加，線粒體Cyt-C可直接介導細胞凋亡。大量研究結果支持Cyt-C的釋放促進細胞凋亡。caspase在細胞凋亡過程中也發(fā)揮著重要的促進作用。研究發(fā)現(xiàn)Cyt-C的釋放早于caspase的活化，對Cyt-C和caspase的深入研究將進一步揭示一些疾病的發(fā)生發(fā)展機制，并可能提供疾病預防和治療的新思路。

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