I型小肽載體的結(jié)構(gòu)及活性調(diào)控研究進(jìn)展

河北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 梁陳沖 陳寶江＊ 李紹華

蛋白質(zhì)吸收代謝機(jī)制一直是動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)研究的重點(diǎn)，傳統(tǒng)蛋白質(zhì)理論認(rèn)為蛋白質(zhì)只有被降解成游離氨基酸才能夠被機(jī)體吸收代謝。當(dāng)Ⅰ型小肽載體（PepT1）在腸道被成功克隆后，小肽能被小腸吸收的觀點(diǎn)才逐漸被廣泛地接受。韓非等（2003）報(bào)道，動(dòng)物體內(nèi)已發(fā)現(xiàn)的小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體包括 PepT1、PepT2、PTR3、 大鼠的肽/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PHT1）和人的肽/組氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)載體（hPHT），其中研究最廣泛的是PepT1。小腸對(duì)小肽的吸收是通過(guò)位于小腸上皮細(xì)胞刷狀緣膜的H+耦合的肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體（PepT1）進(jìn)行的，而質(zhì)子是作為肽轉(zhuǎn)運(yùn)的驅(qū)動(dòng)力發(fā)揮作用的。迄今為止，PepT1是唯一被克隆的小腸肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體，已經(jīng)分別從人類(lèi)、鼠、家兔、綿羊、雞、豬和結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2中克隆出該載體蛋白 （Klang 等，2005；Chen 等，2002a、b；Pan等 ，2001；Walker 等 ，1998；Liang 等 ，1995；Satio等，1995；Boll等，1994）。

1 PepT1分子結(jié)構(gòu)特征

目前對(duì)小肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的基因和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究證明，兔子、大鼠、綿羊、奶牛、雞、豬和人的小腸 PepT1 mRNA 長(zhǎng)分別為 2.9、2.9 ～ 3.0、2.8、2.8、2.9、3.5、3.3 kb （Pan 等，2001；Miyamote 等，1996；Liang等，1995；Fei等，1994）。 對(duì) PepT1 分子結(jié)構(gòu)的研究表明，不同動(dòng)物的PepT1氨基酸序列長(zhǎng)度存有差別，其中雞的序列最長(zhǎng)，為714個(gè)殘基（Chen 等，2002a、b），牛和兔的最短，為 707 個(gè)殘基（Fei等，1994），但分子質(zhì)量均為 79 kD，分子結(jié)構(gòu)也相同，都有12個(gè)跨膜區(qū)域，并在9和10兩個(gè)跨膜區(qū)之間有一個(gè)較大的細(xì)胞外環(huán)，這也是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白最顯著的特征；12個(gè)跨膜區(qū)域的氨基酸序列是高度保守的，但是細(xì)胞外環(huán)的氨基酸保守性較低，在細(xì)胞內(nèi)環(huán)上有蛋白酶激酶C（PKC）和蛋白激酶A （PKA）的磷酸化作用位點(diǎn)；PepT1上的His-57和PepT2上的His-87是最關(guān)鍵的組氨酸殘基，他們可能是轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白發(fā)揮吸收功能時(shí)最關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)；不同動(dòng)物肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸為707～729個(gè)，且不同動(dòng)物相同器官肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的同源性高，同種動(dòng)物不同器官肽轉(zhuǎn)運(yùn)載體的同源性低（韓非等，2003）。

2 PepT1組織分布

雖然不同動(dòng)物PepT1的組織分布不同，但所有動(dòng)物小腸都有PepT1表達(dá)，而在肌肉、心臟則未曾檢出PepT1 mRNA的存在，其他部位的表達(dá)情況則不同動(dòng)物有所不同。Chen等（1999）研究表明，雞在小腸、盲腸、腎臟都有PepT1分布，嗉囊、腺胃和肝臟不存在；Fei等（1994）報(bào)道，兔除了小腸有PepT1的表達(dá)以外，在腎臟、肝臟和大腦也有少量存在，但胃和盲腸沒(méi)有表達(dá)；大鼠在腎臟有微量表達(dá)，肝臟中無(wú)表達(dá)；綿羊和奶牛的小腸、瓣胃和瘤胃有PepT1的表達(dá)，在真胃、肝臟、腎臟、盲腸和結(jié)腸中未檢測(cè)到。

Chen等（1999）報(bào)道，從PepT1在腸道的表達(dá)強(qiáng)度來(lái)看，不同動(dòng)物也存在差異，雞主要以十二指腸為主，豬以空腸為主，反芻動(dòng)物則以空腸和回腸為主。假設(shè)以mRNA豐度來(lái)表示小腸不同部位轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的含量，那么可以認(rèn)為在小腸各部位的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性具有一定差異，這種種屬之間的差異可以反映出蛋白質(zhì)消化部位和對(duì)小肽的利用程度。

3 PepT1的活性調(diào)控

PepT1是一類(lèi)低親和力/高容量的肽載體，研究表明，底物、激素、生長(zhǎng)因子、酶、飼糧營(yíng)養(yǎng)水平和飼養(yǎng)管理等因素都能在一定程度上對(duì)其活性起到調(diào)控作用。

3.1 底物的調(diào)控 Pan等（2001）認(rèn)為，PepT1對(duì)底物分子具有廣泛的適應(yīng)性，幾乎可以轉(zhuǎn)運(yùn)所有的二肽和三肽。此外，PepT1還可以轉(zhuǎn)運(yùn)多肽類(lèi)衍生物，其中包括β-內(nèi)酰胺抗生素、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑、凝血酶抑制劑和類(lèi)二肽抗癌藥物及多種藥物前體物。但體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肽載體對(duì)底物也有一定的選擇性，可以選擇轉(zhuǎn)運(yùn)不同分子結(jié)構(gòu)的底物。

小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)與底物的濃度也有關(guān)系，底物濃度高時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)量較大。Erickson等（1995）在小鼠試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，高蛋白質(zhì)（50%）日糧組小腸中段和遠(yuǎn)端PepT1 mRNA豐度比低蛋白質(zhì)（4%）日糧組高1.5～2倍。Shiraga等（1999）試驗(yàn)也表明，在小鼠標(biāo)準(zhǔn)日糧中添加二肽（Gly-Phe），能增加PepT1基因表達(dá)。Chen等（2005）在雞的試驗(yàn)中使用不同的飼糧蛋白質(zhì)水平 （CP含量分別為12%、18%和24%），并保證各處理采食量相同，結(jié)果顯示，隨著蛋白質(zhì)采食的增加，小腸中PepT1 mRNA豐度增加（P＜0.05），且在不同的組織中存在差異，空腸中PepT1 mRNA豐度高于十二指腸和回腸（P＜0.05）。可見(jiàn)，高蛋白質(zhì)日糧增加了腸道中二肽、三肽和氨基酸的濃度，這些產(chǎn)物作為PepT1基因表達(dá)的信號(hào)因子，增加小腸刷狀緣膜上的肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的水平，而最終使肽轉(zhuǎn)運(yùn)增加。

Chen 等（2002b）進(jìn)行的[3H]-Gly-Sar吸收的抑制試驗(yàn)表明，二肽和三肽能明顯抑制[3H]-Gly-San的吸收，這說(shuō)明這些小肽可能作用于相同的轉(zhuǎn)運(yùn)位點(diǎn)，相互競(jìng)爭(zhēng)，而該轉(zhuǎn)運(yùn)載體對(duì)游離的氨基酸及四肽以上寡肽不進(jìn)行吸收，因而對(duì)[3H]-Gly-Sar的吸收無(wú)抑制作用。施用輝等（1996）向來(lái)航公雞十二指腸灌注小肽的試驗(yàn)結(jié)果表明，腸道吸收底物中小肽所占的比例是影響吸收速度的重要元素，小肽比例越高氨基酸吸收越快。孫炳偉等（2003）采用頭孢氨芐作為研究底物，Caco2細(xì)胞作為小腸上皮細(xì)胞模型，比較重組人生長(zhǎng)激素對(duì)正常和缺氧復(fù)氧損傷后Caco2細(xì)胞PepT1功能的影響和調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)缺氧復(fù)氧損傷后，Caco-2細(xì)胞間隙增大，其特有的緊密連接結(jié)構(gòu)被破壞；二肽載體的mRNA數(shù)量明顯降低；對(duì)頭孢氨芐的攝取量大大減少。

3.2 激素的調(diào)控

3.2.1 胰島素對(duì)PepT1的調(diào)節(jié) 胰島素被認(rèn)為是代謝調(diào)控的一個(gè)重要因素，尤其對(duì)肌肉中葡萄糖和氨基酸的轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)控。Nielsen等（2003）報(bào)道，胰島素短期刺激能增加Caco-2細(xì)胞攝取Gly-Ser的能力，但其上調(diào)作用與PepT1基因表達(dá)和質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力無(wú)關(guān)。Meredith和Boyd（2000）早期關(guān)于胰島素調(diào)控肽轉(zhuǎn)運(yùn)的報(bào)道表明，胰島素通過(guò)增加肽載體的數(shù)量刺激肽的吸收，這種數(shù)量的增加是胞漿池中轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)移造成的。Thamotharan等（1999）試驗(yàn)表明，在Caco-2細(xì)胞系培養(yǎng)基中添加生理濃度（5 nmol/L）的胰島素，培養(yǎng)1 h，能顯著增加小腸刷狀緣膜上二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)，其作用主要是通過(guò)胰島素與位于小腸基底膜上的受體結(jié)合，如果破壞胰島素與其受體的結(jié)合，胰島素的作用消失。從動(dòng)力學(xué)參數(shù)進(jìn)行分析，胰島素對(duì)PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)二肽 （Gly-Gln）的Km值沒(méi)有顯著影響，但Vmax提高2倍，表明胰島素不能提高PepT1對(duì)底物的轉(zhuǎn)運(yùn)活性，但能提高刷狀緣膜上PepT1的濃度。膜上PepT1數(shù)量增加的機(jī)制表明，當(dāng)破壞對(duì)重新合成PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用的高爾基體，胰島素的作用仍然存在；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，胰島素處理對(duì)腸黏膜上PepT1基因水平?jīng)]有顯著影響，說(shuō)明胰島素不能提高PepT1的合成，但如果破壞了對(duì)已合成PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)起重要作用的微管，胰島素的作用則消失。

3.2.2 甲狀腺激素對(duì)PepT1的調(diào)節(jié) 甲狀腺激素是由甲狀腺分泌的，維持動(dòng)物正常的生長(zhǎng)發(fā)育、正常的體溫和正常的能量水平，它的大多數(shù)作用是通過(guò)激活細(xì)胞核受體而進(jìn)行調(diào)節(jié)的，導(dǎo)致mRNA和蛋白質(zhì)合成的增加。Ashid等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，T3會(huì)明顯減少Caco-2細(xì)胞對(duì)[14C]Gly-Sar吸收的Vmax，且不影響Km值，PepT1及PepT1 mRNA的水平下降，表明甲狀腺素抑制肽的轉(zhuǎn)運(yùn)可能是降低PepT1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平或影響其穩(wěn)定性。

3.2.3 瘦素對(duì)PepT1的調(diào)節(jié) 隨著瘦素的發(fā)現(xiàn)，對(duì)瘦素在肽吸收方面的調(diào)控作用也有了一些報(bào)道。Buyse等（2001）在Caco-2細(xì)胞系培養(yǎng)基中加入2 nmol/L瘦素，培養(yǎng)30 min，結(jié)果表明，瘦素能增加刷狀緣膜上Gly-Sar的轉(zhuǎn)運(yùn)，對(duì)基底膜上二肽的轉(zhuǎn)運(yùn)沒(méi)有影響；其PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)動(dòng)力學(xué)參數(shù)Vmax上升，Km保持不變，同時(shí)增加細(xì)胞膜上PepT1含量，降低胞內(nèi)PepT1含量，但PepT1 mRNA水平?jīng)]有改變?？梢?jiàn)，瘦素對(duì)PepT1的調(diào)節(jié)機(jī)制和胰島素相同，都是通過(guò)增加PepT1從細(xì)胞質(zhì)到小腸刷狀緣膜的轉(zhuǎn)運(yùn)，而不是增加其mRNA的表達(dá)來(lái)對(duì)膜上PepT1水平進(jìn)行調(diào)節(jié)。

3.2.4 表皮生長(zhǎng)因子對(duì)PepT1的調(diào)節(jié) 表皮生長(zhǎng)因子（EGF）刺激表皮細(xì)胞和其他多種上皮和非上皮細(xì)胞的增殖，調(diào)節(jié)胃腸道分化與發(fā)育。其主要有兩種不同的方式對(duì)PepT1進(jìn)行調(diào)節(jié)，一種是長(zhǎng)期作用，一種是短期作用。Nielsen等（2001）發(fā)現(xiàn)，EGF長(zhǎng)期培養(yǎng) （26～28 d）Caco-2細(xì)胞能夠降低Gly-Sar轉(zhuǎn)運(yùn)量50%左右，Vmax降低90%，Km保持不變，同時(shí)PepT1mRNA表達(dá)水平和細(xì)胞膜PepT1蛋白表達(dá)量都明顯降低，表明EGF是通過(guò)下調(diào)PepT1基因表達(dá)降低細(xì)胞二肽轉(zhuǎn)運(yùn)能力的。而Nielsen等（2003）的另一次研究發(fā)現(xiàn)，EGF刺激5 min即能增加Caco-2細(xì)胞攝取Gly-Ser的能力，并于10～20 min后達(dá)到平臺(tái)期，Vmax提高了50%左右，Km不變，但并未影響PepT1 mRNA豐度和H+濃度，同時(shí)其促轉(zhuǎn)運(yùn)作用未受蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑的影響，表明EGF處理不會(huì)影響PepT1蛋白的合成。

總的來(lái)說(shuō)，短期調(diào)節(jié)激素主要是通過(guò)影響PepT1在細(xì)胞內(nèi)和膜上的分布來(lái)調(diào)節(jié)膜上PepT1的濃度，而長(zhǎng)期調(diào)節(jié)激素主要是通過(guò)影響PepT1 mRNA水平 （影響轉(zhuǎn)錄或其半衰期）來(lái)影響膜上PepT1的表達(dá)。

3.3 蛋白激酶C和環(huán)化腺苷酸對(duì)PepT1的調(diào)節(jié)在PepT1結(jié)構(gòu)中有一個(gè)蛋白激酶C位點(diǎn)（PKC，Ser-3 5 7）和cAMP依賴(lài)性磷酸化位點(diǎn)（PKA，Thr-362）。 Brandsch 等（1994）報(bào)道，用佛波醇處理Caco-2激活蛋白激酶C（PKC）明顯抑制二肽轉(zhuǎn)運(yùn)，該抑制作用是特異性的，可被蛋白激酶抑制劑staurosporine阻斷，其抑制作用與載體最大轉(zhuǎn)運(yùn)速率減低有關(guān)，并不改變其親和力和質(zhì)子驅(qū)動(dòng)力，而蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮對(duì)該效應(yīng)無(wú)影響。Chen等（2002a）用staurosporine抑制PKC活性則明顯增加PepT1肽載體對(duì)[3H]-Gly-Sar的轉(zhuǎn)運(yùn)，這種增加效應(yīng)可被佛波醇12-豆蔻酸-13-醋酸酯（PMA、PKC激活劑）阻斷，蛋白質(zhì)合成抑制劑放線(xiàn)菌酮對(duì)該效應(yīng)也無(wú)影響。Muller等（1996）用霍亂毒素、腺苷酸環(huán)化酶激活劑、大腸桿菌內(nèi)毒素、磷酸二酯酶抑制劑3-異丁基-1-甲基黃嘌呤處理細(xì)胞，提高Caco-2細(xì)胞內(nèi)cAMP水平，抑制細(xì)胞對(duì)Gly-Sar的吸收，而霍亂毒素抑制作用也可被蛋白激酶抑制劑staurosporine、PKA抑制劑H-89和PKC抑制劑Chelerythrine所阻斷。

3.4 營(yíng)養(yǎng)和飼養(yǎng)管理對(duì)PepT1的調(diào)節(jié) 研究發(fā)現(xiàn)，小腸體內(nèi)和體外對(duì)二肽的吸收隨日糧蛋白水平和肽水平的提高而增加。Shiraga等（1999）用鼠作為動(dòng)物模型就日糧中蛋白質(zhì)水平對(duì)腸道中PepT1表達(dá)量的影響進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，50%酪蛋白組鼠腸道中PepT1 mRNA的表達(dá)量高于20%酪蛋白組，Gly-Phe二肽飼料組鼠腸道中PepT1 mRNA的表達(dá)量高于無(wú)蛋白質(zhì)飼料組，但沒(méi)有達(dá)到顯著水平。Chen等（2005）研究了日糧蛋白質(zhì)水平和限制飼喂對(duì)生長(zhǎng)肉雞腸道中PepT1 mRNA表達(dá)量的影響發(fā)現(xiàn)，限制采食的3個(gè)處理中，腸道PepT1 mRNA表達(dá)量的高低與蛋白質(zhì)水平呈正相關(guān)。 Erickson（1995）用低蛋白質(zhì)日糧（4%）和高蛋白質(zhì)日糧（50%）飼養(yǎng)大鼠，結(jié)果表明，飼喂高蛋白日糧組的大鼠，其小腸中段和末段增加的PepT1mRNA是低蛋白質(zhì)日糧組的1.5～2倍。

在畜禽飼養(yǎng)中，短期缺食是很常見(jiàn)的。研究發(fā)現(xiàn)，饑餓也能通過(guò)增加PepT1 mRNA和蛋白表達(dá)水平，促進(jìn)小肽的攝入。Ihara等（2000）通過(guò)對(duì)采食量的控制，研究大鼠在營(yíng)養(yǎng)不良條件下，小腸PepT1基因表達(dá)作用，結(jié)果表明，短期缺食可使腸道中PepT1 mRNA和蛋白的表達(dá)上調(diào)。Ferraris等（1998）報(bào)道，無(wú)論是短暫的還是長(zhǎng)時(shí)間的饑餓，都會(huì)增加PepT1 mRNA水平，從而增加小腸黏膜刷狀PepT1數(shù)量。從生理上講，饑餓使得小腸吸收面積減少，而靠增加小肽載體的數(shù)量來(lái)彌補(bǔ)。在營(yíng)養(yǎng)不良條件下，體脂和糖原作為能量貯備而被利用，由于蛋白質(zhì)是組織結(jié)構(gòu)的組成部分和生物活性物質(zhì)，在體內(nèi)并沒(méi)有貯存庫(kù)，蛋白質(zhì)的損失或缺乏將導(dǎo)致生理功能的迅速下降。因此，在營(yíng)養(yǎng)不良條件下PepT1 mRNA表達(dá)上調(diào)可能是一種適應(yīng)性機(jī)制。在日糧供給后，使機(jī)體能迅速吸收小肽，假如這種上調(diào)機(jī)制出現(xiàn)遲緩，那么必需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)小腸吸收效率將會(huì)大大降低，導(dǎo)致動(dòng)物生產(chǎn)性能顯著下降。

3.5 其他 Pan等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，晝夜節(jié)律也可影響肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)和活性，小腸PepT1 mRNA豐度和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白含量在 16∶00～24∶00比較高，在24∶00對(duì)[14C]Gly-Sar的吸收率顯著高于12∶00。 但 Pan 等（2001）在對(duì)小鼠實(shí)行白天飼喂時(shí)，發(fā)現(xiàn)小腸黏膜中PepT1的晝夜變化規(guī)律與自由采食完全相反。可見(jiàn)，是采食變化引起PepT1的晝夜變化而不是光照的作用。另有報(bào)道PepT1轉(zhuǎn)運(yùn)活性與年齡有關(guān)，但各報(bào)道有所不一。Marion等（2001）研究表明，動(dòng)物肥胖基因的產(chǎn)物L(fēng)eptin可以使小肽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對(duì)小肽的轉(zhuǎn)運(yùn)活性增強(qiáng)，表現(xiàn)為腸細(xì)胞內(nèi)PepT1的含量減少，細(xì)胞膜上的含量增多，另外，體外吸收試驗(yàn)表明，Leptin可明顯促進(jìn)Caco-2細(xì)胞對(duì)二肽Gly-Sar的吸收。

4 研究PepT1的意義和存在的問(wèn)題

小肽是日糧蛋白質(zhì)在小腸中重要的消化產(chǎn)物。研究PepT1結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和調(diào)控方法，小肽在機(jī)體內(nèi)消化吸收機(jī)理和轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程，對(duì)了解小肽生理功能及對(duì)機(jī)體進(jìn)行合理供應(yīng)都具有重要的生物學(xué)意義。

盡管人們對(duì)PepT1有了一定研究，但這些大多集中在對(duì)不同種類(lèi)動(dòng)物PepT1結(jié)構(gòu)及分布上，缺乏系統(tǒng)研究參與PepT1 mRNA及其表達(dá)蛋白活性調(diào)節(jié)因素的作用機(jī)制、如何利用這些調(diào)節(jié)因素提高蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)吸收以及小肽不同于游離氨基酸吸收利用的特點(diǎn)，而這些對(duì)于正確理解蛋白質(zhì)營(yíng)養(yǎng)、為動(dòng)物配制平衡蛋白質(zhì)日糧具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

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