不同形式的氮源對(duì)活體外瘤胃氨氮釋放和發(fā)酵參數(shù)的影響

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 辛杭書(shū) 張永根

中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 孟慶翔＊

美國(guó)蘭科礦物質(zhì)公司 Dirk E A

國(guó)際原料公司 劉慶平

氨是瘤胃微生物生長(zhǎng)發(fā)育所必需的物質(zhì)，而瘤胃中的氨來(lái)自于氨基酸的脫氨基和非蛋白氮（NPN）的降解。尿素作為一類含氮高、成本低、經(jīng)濟(jì)有效的非蛋白氮產(chǎn)品，被廣泛應(yīng)用于反芻動(dòng)物生產(chǎn)中，但其降解過(guò)快（降解速度是微生物利用速度的4倍）及碳氮源發(fā)酵不同步是造成尿素利用率低的主要限制因素。所以，國(guó)內(nèi)外研究學(xué)者千方百計(jì)的探討如何達(dá)到尿素在瘤胃內(nèi)緩釋氨氮，或?qū)⒛蛩嘏c谷物淀粉（Helmer等，1970）、糖蜜等通過(guò)加壓加熱處理生產(chǎn)各種復(fù)合尿素產(chǎn)品（Madhu Mohini和Gupta，1993），或?qū)⒛蛩剡M(jìn)行包被處理（Galo 等，2003；Tedeschi等，2002），但將這些產(chǎn)品應(yīng)用到實(shí)踐中，效果并不一致。

Helmer等（1970）率先提出糊化淀粉尿素中變性的淀粉組分更容易被細(xì)菌和原蟲(chóng)利用，微生物蛋白產(chǎn)量比單用尿素與谷物混合飼喂時(shí)明顯提高。我國(guó)畜牧工作者也對(duì)糊化尿素制備及實(shí)踐應(yīng)用進(jìn)行研究，取得了較滿意的效果（單達(dá)聰和熊六飛，2007；顧炳龍等，1996）。糊化淀粉尿素是在適合溫度（121～176℃）及壓力（28～35 kg/cm2或2744～3430 kPa）下，生成的淀粉與尿素的均勻混合物。而有學(xué)者提出，在顆粒料生產(chǎn)過(guò)程中的高溫高壓條件下，飼料原料中所含的尿素、胺鹽等含氮有機(jī)化合物有可能部分聚合為“三聚氰胺”類的化合物（林建云，2008）。然而，糊化淀粉尿素中是否有可能含“三聚氰胺”尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)選用普通尿素、糊化淀粉尿素、包被尿素（快速型和慢速型）和大豆分離蛋白，比較這五種不同形式氮源體外氨氮釋放速度，并分別測(cè)定“三聚氰胺”的含量，為在反芻動(dòng)物生產(chǎn)中安全合理使用尿素提供試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源 玉米采自河北凱特飼料廠，品種為當(dāng)?shù)赜衩祝缅N片式粉碎機(jī)粗粉碎（孔徑約為2 mm）后再用旋風(fēng)磨（1.0 mm）進(jìn)一步細(xì)粉碎，置于塑料封口袋中供下一步組分分析及配料使用。普通尿素為化學(xué)純，糊化尿素為商品來(lái)源，蛋白質(zhì)含量為74.8%；兩種包被尿素均來(lái)自于美國(guó)Granco公司，以不能被瘤胃降解的聚氨基甲酸酯為包被材料，采用特殊的半透膜包被技術(shù)，主要成分含量為：尿素78%～96%，蠟質(zhì)0.3%～0.5%，色素0% ～0.11%。

1.2 樣品準(zhǔn)備及試驗(yàn)設(shè)計(jì) 參考美國(guó)NRC肉牛營(yíng)養(yǎng)需要，根據(jù)每種原料由氮素自動(dòng)分析儀（Rapid N III，Elementar，Germany）測(cè)定的蛋白質(zhì)含量配制成蛋白質(zhì)含量為12.5%（干物質(zhì)基礎(chǔ)）的半純合等氮日糧，以玉米作為主要碳源底物，添加不同形式的氮源即普通尿素（負(fù)對(duì)照）、包被尿素（快速和慢速）、糊化淀粉尿素和大豆分離蛋白，采用單因子試驗(yàn)設(shè)計(jì)，每種日糧設(shè)3個(gè)平行，整個(gè)試驗(yàn)在不同天內(nèi)重復(fù)2次。

1.3 活體外發(fā)酵

1.3.1 活體外人工瘤胃產(chǎn)氣量測(cè)定 采用Menke等 （1979）的活體外產(chǎn)氣法進(jìn)行體外試驗(yàn)。將0.2 g（精確至0.0001 g）的不同日糧放入100 mL人工瘤胃培養(yǎng)管（德國(guó)H?berle公司，有效體積100 mL，最小分度1 mL）中，39℃預(yù)熱。于晨飼前通過(guò)瘤胃瘺管分別采集4頭試驗(yàn)牛的瘤胃內(nèi)容物，等體積混合后，以4層紗布過(guò)濾，并迅速加入裝有經(jīng)CO2飽和并預(yù)熱39℃的緩沖液中，配制成混合培養(yǎng)液（瘤胃液與緩沖液配比為1∶2）。用自動(dòng)加液器向各培養(yǎng)管加入30 mL混合培養(yǎng)液，迅速放入已預(yù)熱（39℃）的活體外人工瘤胃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，一組培養(yǎng)管（三個(gè)）用于測(cè)定產(chǎn)氣量，分別記錄培養(yǎng) 1、2、3、4、5、6、8、10、12、16、20、24、28、32、36、40、44、48、56、64 h 和 72 h 各培養(yǎng)管活塞的刻度值（mL）。

同時(shí)，將各組底物進(jìn)行另一批次3個(gè)重復(fù)的培養(yǎng)，測(cè)定24 h底物干物質(zhì)的消化率。在39℃培養(yǎng)24 h后，將培養(yǎng)管中內(nèi)容物全部倒入50 mL離心管中，5400 r/min離心15 min，沉淀烘干用于計(jì)算干物質(zhì)消化率。上清液用于測(cè)定pH、揮發(fā)性脂肪酸（VFA）和NH3-N濃度等瘤胃發(fā)酵參數(shù)。活體外發(fā)酵試驗(yàn)重復(fù)2次進(jìn)行。

1.3.2 主要檢測(cè)指標(biāo)及分析方法 分別在0、1、2、4、6、8、12、18 h 和 24 h 取發(fā)酵液，離心后-20 ℃下冷凍，供NH3-N的測(cè)定，并測(cè)定24 h的VFA含量和干物質(zhì)消化率。pH值采用雷磁PHS-3C型精密pH計(jì)（數(shù)顯讀數(shù)精度0.01）發(fā)酵結(jié)束后迅速測(cè)定；NH3-N濃度測(cè)定采用 Broderick和 Kang（1980）的方法；VFA含量采用3420氣相色譜儀（北京分析儀器廠）進(jìn)行分析。取1mL分離液相，加入0.2 mL 25%（m/V）偏磷酸搖勻后冰浴超過(guò)30 min，10000 g離心10 min，取上清液用于色譜分析。色譜條件：PEG-20M+H3PO4玻璃填充柱，色譜柱為內(nèi)徑3 mm、長(zhǎng)2 m；載氣為氮?dú)?，流?5 mL/min，氫氣流速35 mL/min，空氣流速250 mL/min，氫焰離子檢測(cè)器，柱溫150℃，離子化室溫度 220 ℃，靈敏度 107，衰減 4，進(jìn)樣量 0.6 μL；干物質(zhì)測(cè)定采用國(guó)標(biāo)GB/T 6435-1986；三聚氰胺的測(cè)定采用農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1372-2007。

1.4 統(tǒng)計(jì)處理 采用SAS（1996）統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行兩因子方差分析，計(jì)算0.2000 g日糧干物質(zhì)活體外凈產(chǎn)氣量（72 h），并根據(jù)數(shù)學(xué)模型GP=B×[1-exp（-c × t）]，利用 SAS（1996）統(tǒng)計(jì)軟件中 NONLINEAR方法計(jì)算樣本的動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣參數(shù)，式中：GP為t時(shí)間點(diǎn)0.2000 g底物DM的產(chǎn)氣量，mL；B為0.2000 g底物DM的理論最大產(chǎn)氣量，mL；c為樣本產(chǎn)氣速度，h；t為活體外培養(yǎng)時(shí)間，h。

產(chǎn)氣量、產(chǎn)氣參數(shù)、干物質(zhì)消化率及瘤胃發(fā)酵參數(shù)等各項(xiàng)檢測(cè)指標(biāo)均采用SAS統(tǒng)計(jì)分析軟件（SAS，1999）中的廣義線性模型（GLM）進(jìn)行獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同形式氮源對(duì)活體外瘤胃氨氮釋放動(dòng)態(tài)的影響 表1列出了活體外發(fā)酵中含不同形式氮源的日糧0～24 h氨氮濃度變化的結(jié)果。從表中可以看出，不同形式氮源顯著影響0～12 h氨氮釋放速度（P＜0.05），其中兩種包被尿素的氨氮濃度在各時(shí)間點(diǎn)均低于其他處理組。從整體趨勢(shì)上看，所有處理組的氨態(tài)氮濃度在0～1 h上升，然后逐漸下降，在8 h（普通尿素組和糊化尿素組）或12 h（包被尿素組和大豆分離蛋白組）再次上升。糊化尿素組的氨態(tài)氮濃度均與普通尿素組相一致，未見(jiàn)顯著差異，前人的一些研究也發(fā)現(xiàn)將糊化尿素添加到動(dòng)物飼糧中，并沒(méi)有明顯改善瘤胃中氨氮的釋放速度（Coppock等，1976），這可能與糊化尿素的制作原料的選用及生產(chǎn)方法不同有關(guān)。本試驗(yàn)中，未見(jiàn)其能顯著減緩氨氮釋放速度，也可能是糊化尿素制作過(guò)程中對(duì)玉米的糊化程度不足所致。而對(duì)于兩種包被尿素，除在4 h時(shí)，快速釋放包被尿素的氨氮濃度顯著高于慢速釋放包被尿素外 （P＜0.0001），其余時(shí)間點(diǎn)均無(wú)明顯影響，并且與大豆分離蛋白組氨氮的釋放趨勢(shì)相似。

表1 不同形式氮源的活體外發(fā)酵氨氮濃度動(dòng)態(tài)變化mg/100 mL

從表1可以看出，每種氮源處理日糧的氨氮濃度都先升高，再逐漸降到最低，然后再次上升，這可能是由于隨著飼糧的發(fā)酵和微生物的利用所導(dǎo)致氮素的不足，從而使瘤胃液中微生物自身發(fā)生分解所致。

本試驗(yàn)中還分別對(duì)各種原料進(jìn)行了“三聚氰胺”的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)除了糊化尿素外，其他原料均未檢出。而糊化尿素中的“三聚氰胺”檢出量為24 mg/kg。林建云（2008）在探討“顆粒飼料與三聚氰胺”時(shí)提出，顆粒配合飼料的造粒過(guò)程中很有可能產(chǎn)生三聚氰胺類物質(zhì)，糊化尿素的生產(chǎn)同樣也是在高溫高壓下將谷物淀粉、尿素及其他一些緩釋劑混合糊化而成，與顆粒飼料的生產(chǎn)過(guò)程相似，所以很有可能是在糊化淀粉制作過(guò)程中促進(jìn)了三聚氰胺的合成。但也有研究學(xué)者認(rèn)為糊化淀粉的加工溫度為80～125℃，壓力為1.8～3.0 MPa，溫度不夠，沒(méi)有催化劑，與三聚氰胺生產(chǎn)所需的條件不相吻合，不具備產(chǎn)生三聚氰胺的化學(xué)反應(yīng)條件（李勝利，2008）。 林祥梅等（2008）采用灌胃方式給予小鼠三聚氰胺，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在日糧中添加三聚氰胺飼喂小鼠的全部不致死的最大劑量是5000 mg/kg。而本試驗(yàn)中糊化淀粉中三聚氰胺的含量遠(yuǎn)未達(dá)到此劑量，但對(duì)于糊化淀粉過(guò)程是否能產(chǎn)生三聚氰胺類化合物及其在飼料原料中使用安全性的機(jī)理性研究還尚未見(jiàn)報(bào)道，仍有待進(jìn)一步探討。

2.2 含不同形式氮源日糧對(duì)活體外發(fā)酵動(dòng)態(tài)產(chǎn)氣參數(shù)和發(fā)酵參數(shù)的影響 見(jiàn)表2。由表2顯示，普通尿素組的72 h產(chǎn)氣量在數(shù)值上比其他處理組低1.65～2.86 mL，但統(tǒng)計(jì)上差異并不顯著（P>0.05），同樣，產(chǎn)氣速度、pH及24 h干物質(zhì)消化率也未見(jiàn)明顯變化。日糧發(fā)酵后的產(chǎn)氣量及揮發(fā)酸總量主要與其中的碳水化合物含量有密切相關(guān)，五種處理日糧均以玉米為主要碳源，所以其產(chǎn)氣量和總揮發(fā)酸含量均未見(jiàn)顯著性差異。而對(duì)于各種揮發(fā)酸的摩爾比例，不同氮源顯著影響發(fā)酵液中戊酸的含量，其中大豆分離蛋白組具有最高的戊酸含量 （1.34 mmol/100 mol總揮發(fā)性脂肪酸），包被緩釋尿素 （慢速）組的戊酸含量最低（1.13 mmol/100 mol總揮發(fā)性脂肪酸），其他處理組居中。戊酸是瘤胃發(fā)酵過(guò)程中碳水化合物及氨基酸代謝的終產(chǎn)物，主要是賴氨酸和精氨酸這兩種氨基酸的代謝，而有研究顯示（張澤生等，2007），大豆分離蛋白中的賴氨酸和精氨酸的含量分別為47.9 mg/g和61.7 mg/g，而糊化尿素和包被緩釋尿素幾乎不含有氨基酸，這可能造成大豆分離蛋白組戊酸含量高的原因之一。

表2 不同形式氮源日糧活體外產(chǎn)氣動(dòng)態(tài)參數(shù)及發(fā)酵參數(shù)

3 結(jié)論

不同形式的氮源顯著影響活體外瘤胃氨氮釋放速度，兩種包被尿素顯著降低了瘤胃氨氮釋放，與大豆分離蛋白相似，除在4 h時(shí)，快速釋放包被尿素的氨氮濃度顯著高于慢速釋放包被尿素外，其余時(shí)間點(diǎn)均未見(jiàn)二者有顯著的不同；糊化淀粉尿素并沒(méi)有減緩氨氮的釋放，并檢測(cè)出其含有三聚氰胺，雖然其含量較低，但對(duì)其產(chǎn)生的機(jī)理及將其作為原料添加在動(dòng)物飼糧中的安全性研究還有待進(jìn)一步研究。

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