柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定乳與乳制品中羥脯氨酸的含量

北京市飼料監(jiān)察所 魏秀蓮 丁美方 董穎超 楊定忠

皮革水解蛋白是利用皮革下腳料經(jīng)水解而生成的蛋白質(zhì)混合物，其主要成分為膠原蛋白。由于皮革下腳料中含有大量皮革糅制及染色過(guò)程中添加的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉等有毒物質(zhì)，因此用這種原料生產(chǎn)水解蛋白，皮革中的重鉻酸鉀和重鉻酸鈉自然就被帶入產(chǎn)品中。如果長(zhǎng)期食用含有“皮革水解蛋白”的食物，“鉻”重金屬離子便會(huì)被人體吸收、積累、中毒，使人體關(guān)節(jié)疏松腫大，甚至造成兒童死亡。衛(wèi)生部最新引發(fā)了《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單（第二批）》，明令禁止在乳及乳制品中添加皮革水解蛋白。皮革水解蛋白與三聚氰胺不同，是真正的蛋白質(zhì)，因此若被添加到食品中，檢測(cè)難度高于三聚氰胺。皮革水解物主要添加的食品是乳與乳制品及含乳飲料，作用是增加蛋白質(zhì)含量。由于羥脯氨酸具膠原蛋白的特有組分，其含量占膠原蛋白10%以上，而乳蛋白中不含此成分，因此通過(guò)測(cè)定樣品中的羥脯氨酸，則可以判斷樣品中是否添加了皮革水解蛋白。關(guān)于動(dòng)物組織及其他相關(guān)產(chǎn)品中羥脯氨酸的液相檢測(cè)方法已有報(bào)道（崔勇等，2008；鄭家概等，2008；孫光臣和劉英芹，2004），而關(guān)于乳及乳制品中的羥脯氨酸的檢測(cè)，尚未見(jiàn)報(bào)道，本文建立了測(cè)定乳與乳制品中羥脯氨酸的柱前衍生高效液相色譜法（HPLC）。

1 儀器與試劑

Agilent 1100高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫公司）；恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；氮吹儀（天津博納艾杰爾科技有限公司）。

羥脯氨酸對(duì)照品、正亮氨酸對(duì)照品、異硫氰酸苯酯（天津博納艾杰爾科技有限公司）；乙腈為色譜純（美國(guó)Honeywell公司），水為重蒸餾水，其余試劑均為分析純。

2 試驗(yàn)方法

2.1 色譜條件 色譜柱：Agela Venusil-AA氨基酸分析專用色譜柱 （天津博納艾杰爾科技有限公司）；流動(dòng)相A：稱取無(wú)水醋酸鈉 8.2 g，加水800 mL，溶解后用冰醋酸調(diào)pH至6.5，然后加水至 1000 mL，加乙腈 75 mL，混勻，用 0.45 μm 濾膜過(guò)濾；流動(dòng)相B：80%乙腈（V/V）；梯度洗脫，洗脫程序見(jiàn)表1。流速：1 mL/min；柱溫40℃；進(jìn)樣量 50 μL。

表1 梯度洗脫程序表

2.2 溶液的配制 0.1 mol/L鹽酸溶液：量取8.3 mL濃鹽酸，加水稀釋至1000 mL。6 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯0.1 g，加濃鹽酸50 mL和水50 mL溶解，混勻。12 mol/L鹽酸溶液（含0.1%苯酚）：稱取苯酚0.1 g，加濃鹽酸100 mL溶解，混勻。正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液：稱取正亮氨酸約10 mg，加0.1 mol/L鹽酸溶液 10 mL使溶解，混勻。三乙胺乙腈溶液：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混勻。異硫氰酸苯酯乙腈溶液：取異硫氰酸苯酯25 μL，加乙腈2 mL，混勻。羥脯氨酸（C5H9NO3）標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液 500 μg/mL:稱取 50.0 mg羥脯氨酸用0.1 mol/L鹽酸溶解并，定容至100mL容量瓶中。 標(biāo)準(zhǔn)工作液25 μg/mL:吸取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.00 mL置于100 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容至刻度，混勻，準(zhǔn)確量取1.0 mL，置1.5 mL塑料離心管，準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液 100 μL，混勻。

2.3 樣品水解 皮革蛋白粉的水解：準(zhǔn)確稱取皮革蛋白粉10～20 mg，將稱好的樣品放于10～20 mL水解管中，加入5 mL含0.1%苯酚的6 mol/L鹽酸，振搖使樣品溶解或使樣品均勻分散于溶液中，將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍），用氮?dú)庵脫Q空氣后在充氮?dú)鉅顟B(tài)下擰緊螺絲蓋，將已封口水解管放在(110±1)℃的恒溫干燥箱內(nèi)，水解24 h，取出冷卻。打開水解管，將水解液全部轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶中，用0.1 mol/L鹽酸定容，混勻，過(guò)濾，取濾液，作為衍生用樣品溶液。

純牛奶和皮革奶的水解：準(zhǔn)確稱取純牛奶和皮革奶約3 g，分別置于10～20 mL水解管中，每管加入3 mL濃鹽酸（含0.1%苯酚），將水解管放入冷凍劑中，冷凍3～5 min（或置-20℃冰箱中冷凍）。其余步驟同固體樣品水解過(guò)程。

2.4 樣品衍生 準(zhǔn)確量取衍生用樣品溶液1.0 mL，置玻璃管中，準(zhǔn)確加入正亮氨酸內(nèi)標(biāo)溶液100 μL，用真空干燥器在40～50℃真空干燥或用氮吹儀吹干除去鹽酸后，加1.1 mL 0.1 mol/L鹽溶液重新溶解，混勻，量取220 μL，置1.5 mL塑料離心管中，往離心管中加入三乙胺乙腈溶液100 μL，異硫氰酸苯酯乙腈溶液 100 μL，混勻，室溫放置1 h，然后加入正己烷800 μL，振搖后放置10 min，取下層溶液，用 0.45 μm 小濾器過(guò)濾，取濾液適量，用水稀釋5倍后上機(jī)分析。另取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)工作液220 μL，按上述方法衍生處理。

3 結(jié)果與討論

3.1 色譜行為及專屬性實(shí)驗(yàn) 從圖1可以看出羥脯氨酸與其他氨基酸得到很好的分離，與前后氨基酸的分離度大于8.5，表明本方法具有良好的專屬性。

3.2 線性范圍及檢測(cè)下限 精密吸取羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液適量，配制成羥脯氨酸濃度分別為200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0.78125、0.3125、0.078125 μg/mL的系列樣本， 按 2.4制備對(duì)照品溶液，并進(jìn)行色譜分析，以羥脯氨酸峰面積（Y）對(duì)濃度 （X）進(jìn)行線性回歸得Y=0.0317 X-0.5561（r＝1），以羥脯氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值（Y）對(duì)濃度（X）的進(jìn)行線性回歸得Y=101.87X-0.4124（r＝1），結(jié)果表明在 0.08 ～ 200 μg/mL 的濃度范圍內(nèi)，羥脯氨酸的濃度與峰面積間具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)r=1。羥脯氨酸的最低檢出限為 0.014 μg/mL（S/N=3），定量限為 0.046 μg/mL（S/N=10）。

圖1 19種氨基酸高效液相色譜圖

3.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物重復(fù)進(jìn)樣6次，保留時(shí)間及峰面積的RSD分別為0.07%和0.22%，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

3.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取6.25 μg/mL的羥脯氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液衍生物，按上述色譜條件分別在0、8、16、24、32、48 h測(cè)定，羥脯氨酸峰面積，內(nèi)標(biāo)物峰面積及羥脯氨酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值的RSD分別為0.43%、0.06%、0.43%，結(jié)果表明羥脯氨酸衍生物具有較好的穩(wěn)定性，至少可穩(wěn)定48 h。

3.5 回收率實(shí)驗(yàn) 分別取高 （50 μg/mL）、中（31.25 μg/mL）、低（12.5 μg/mL）三個(gè)濃度進(jìn)行空白加樣回收實(shí)驗(yàn)，回收率為98.2%～99.0%。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 回收率測(cè)定結(jié)果表

3.6 樣品測(cè)定 按上述水解、衍生化及色譜條件對(duì)皮革奶，皮革水解蛋白粉和市售純牛奶進(jìn)行測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果表

圖2 樣品高效液相色譜圖

4 討論與結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了柱前衍生高效液相色譜法測(cè)定乳與乳制品中皮革水解蛋白特征性成分羥脯氨酸含量的方法，高中低濃度加樣回收范圍98.2% ～99.0%。此法簡(jiǎn)單易行，準(zhǔn)確度高，樣品中各氨基酸分離度好，乳、乳制品及皮革水解蛋白粉中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)羥脯氨酸含量測(cè)定沒(méi)干擾，適用于乳及乳制品中羥脯氨酸的測(cè)定。本方法通過(guò)對(duì)羥脯氨酸含量的測(cè)定，可判定乳與乳制品制品中是否添加了皮革水解蛋白，為皮革奶檢測(cè)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

[1]崔勇，劉智，張博，等.反向高效液相色譜柱前衍生化法測(cè)定保健食品中羥脯氨酸的含量[J].中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18（11）：2247 ～ 2249.

[2]鄭家概，王飛，農(nóng)云軍，等.柱前衍生高效液相色譜法對(duì)動(dòng)物組織中膠原蛋白的測(cè)定[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（12）：1383 ～ 1385.

[3]孫廣臣，劉英芹.高壓液相色譜法測(cè)定腎臟組織羥脯氨酸含量[J].黑龍江醫(yī)藥科學(xué)，2004，27（5）：79 ～ 80.