尾加壓素Ⅱ在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義的探討

劉振玉 劉升 黃亮

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，△胸心外科，江西 南昌 330006

尾加壓素Ⅱ在非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其意義的探討

劉振玉 劉升△黃亮

南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院急診科，△胸心外科，江西 南昌 330006

尾加壓素Ⅱ； 非小細(xì)胞肺癌； 酶聯(lián)免疫吸附試驗

尾加壓素Ⅱ(urotensin-Ⅱ，U-Ⅱ)，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最強(qiáng)縮血管活性肽，其縮血管效應(yīng)比內(nèi)皮素強(qiáng)16倍之多。U-Ⅱ在動脈硬化、心力衰竭等心血管疾病、腎臟及糖尿病等疾病過程中發(fā)揮重要作用［1-2］。除縮血管活性外，U-Ⅱ還是一種具有絲裂原樣作用的自分泌/旁分泌生長因子［3］，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著一定的作用。有關(guān)U-Ⅱ基因及其表達(dá)產(chǎn)物在肺癌中的表達(dá)及其臨床意義的研究，雖有國外少數(shù)報道，但尚無定論［4］。本實驗采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，以非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)手術(shù)切除標(biāo)本、正常肺組織為研究對象，探討U-Ⅱ在NSCLC中的表達(dá)狀況，及U-Ⅱ的表達(dá)水平與肺癌發(fā)生、發(fā)展和病理類型及臨床分期的關(guān)系。

1 資料和方法

1.1 標(biāo)本與試劑

肺癌標(biāo)本取自南昌大學(xué)第一附屬醫(yī)院肺癌手術(shù)切除患者63例，其中男性50例，女性13例，年齡33～72歲，平均50.5歲；經(jīng)病理證實鱗癌33例，腺癌30例，其中高分化鱗癌8例，中分化鱗癌13例，低分化鱗癌12例，高分化腺癌7例，中分化腺癌14例，低分化腺癌9例；臨床分期為Ⅰ+Ⅱ期35例，Ⅲ+Ⅳ期28例；無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移35例，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移28例。另取離腫瘤組織5 cm以上的肺組織作為對照的正常肺組織，共31例；每份標(biāo)本均取3份，放入液氮中保存。主要試劑：U-Ⅱ ELISA試劑盒購自上海繼錦化學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

酶聯(lián)免疫吸附試驗檢測NSCLC、正常肺組織中U-Ⅱ的含量(ng/mL)。操作步驟如下：標(biāo)本收集及處理：新鮮取的肺癌、正常肺組織用PBS洗3次，1 g腫瘤或1 g正常組織放入1 mL PBS中，并在小玻璃皿中勻漿，組織勻漿后12 000 r/min離心1 min，離心后收集上清液備檢查，于-20 ℃保存。

檢測準(zhǔn)備工作：⑴提前20 min從冰箱中取出試劑以平衡至室溫。將20倍的濃縮洗滌液放至37 ℃溫箱，30 min，用雙蒸水稀釋。⑵用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的初始濃度進(jìn)行系列稀釋，每一稀釋要混勻，未用完的標(biāo)準(zhǔn)品立即放入-20 ℃保存，已稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品未用完的丟棄。⑶U-Ⅱ檢測，從已平衡至室溫的密封袋中取出所需板條，其他板條密封放回2～8℃。加入標(biāo)本和已稀釋的不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品各100 μL至相應(yīng)孔中，振蕩混均后置于37 ℃水浴中溫育60 min。洗板，甩盡孔內(nèi)液體，每孔加洗滌液350 μL，靜止30 s后甩盡液體，在厚迭吸水紙上拍干，重復(fù)5次。⑷加入100 μL辣根過氧化酶標(biāo)記的二抗于各孔，37 ℃溫育，60 min。洗板同⑶。⑸每孔加底物OPD各50 μL，避光37 ℃，15 min。⑹每孔加終止液1 N HCL 50 μL。⑺在Vmax 酶聯(lián)分析儀檢測各孔400 nm處的D值標(biāo)準(zhǔn)曲線由儀器完成。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)均以表示，組間對比進(jìn)行方差分析或四方格表精確概略法，數(shù)據(jù)處理由第三軍醫(yī)大學(xué)統(tǒng)計教研室《數(shù)理統(tǒng)計程序包》處理，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 NSCLC組織及正常肺組織U-Ⅱ含量比較

NSCLC組織U-Ⅱ含量(542.40±41.81)ng/mL，明顯高于正常肺組織(17.13±3.21)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 肺癌組織類型U-Ⅱ含量比較

鱗癌患者U-Ⅱ含量(498.50±39.81)ng/mL與腺癌患者(562.00±42.20)ng/mL比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 臨床病期與U-II表達(dá)水平的關(guān)系

Ⅰ+Ⅱ期患者U-Ⅱ含量為(256.00±7.65)ng/mL，明顯低于Ⅲ+Ⅳ期患者的(372.50±19.74)ng/mL，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.4 肺癌組織U-II含量與肺癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系

33例鱗癌患者有21例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，U-Ⅱ含量為(569.50±70.36) ng/mL，12例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移U-Ⅱ含量為(252.50±17.39) ng/mL；30例腺癌患者有22例發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，U-Ⅱ含量為(596.50±42.30) ng/mL，8例無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移U-Ⅱ含量為(283.40±18.48) ng/mL，可見有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者U-Ⅱ含量明顯高于無遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討 論

U-Ⅱ是一種強(qiáng)大的細(xì)胞有絲分裂促進(jìn)劑，像其他促有絲分裂的肽類激素一樣，如腎上腺髓質(zhì)素和內(nèi)皮素-1，能夠以自分泌/旁分泌的方式，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞異常增殖、血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞分化，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲及轉(zhuǎn)移中起重要作用。有關(guān)U-Ⅱ在腫瘤中的表達(dá)，國內(nèi)外近年陸續(xù)有報道［5-7］。有學(xué)者用反向PCR方法研究發(fā)現(xiàn)人類多種腫瘤細(xì)胞中均有U-Ⅱ及其受體mPNA的表達(dá)，如T98G惡性膠質(zhì)細(xì)胞瘤、EMR-32成神經(jīng)細(xì)胞瘤、NB69成神經(jīng)細(xì)胞瘤、BeWO絨毛膜上皮癌、SW-13腎上腺皮質(zhì)腫瘤、DLD-結(jié)腸腺癌及子宮頸細(xì)胞癌。除NB69成神經(jīng)細(xì)胞瘤外，其余9種瘤細(xì)胞株均表達(dá)U-Ⅱ mRNA，而U-Ⅱ受體mRNA在7種腫瘤細(xì)胞均有表達(dá)。通過放射免疫分析法證實，在上述7種腫瘤細(xì)胞中SW-13腎上腺皮質(zhì)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)的上清液中存在U-Ⅱ的免疫反應(yīng)。Eddahibi等［8］研究發(fā)現(xiàn)U-Ⅱ在腎癌細(xì)胞中的免疫活性呈中度表達(dá)。在腎透明細(xì)胞癌組織及血管中也有中等量U-Ⅱ表達(dá)，而癌周炎性細(xì)胞中幾乎無表達(dá)，據(jù)此推測腎腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與U-Ⅱ有關(guān)。Takahashi等［9］檢測出U-Ⅱ受體在橫紋肌肉瘤中的表達(dá)，人類U-Ⅱ可抑制去除血清和腫瘤壞死因子誘導(dǎo)的內(nèi)皮凋亡。本研究采用酶聯(lián)免疫吸附試驗，對63例肺癌手術(shù)切除標(biāo)本及31例離肺癌組織邊緣5 cm以上的肺組織U-Ⅱ的含量進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，U-Ⅱ在肺癌組織中含量明顯增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。同時還發(fā)現(xiàn)各病理類型肺癌U-Ⅱ含量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，故肺癌組織中U-Ⅱ水平與肺癌病理類型無關(guān)。本研究還顯示Ⅰ～Ⅱ期肺癌組織中U-Ⅱ含量明顯低于Ⅲ～Ⅳ期肺癌組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。另外，有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的晚期肺癌患者U-Ⅱ含量明顯高于沒有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的肺癌患者，提示肺癌組織中U-Ⅱ水平的增高與肺癌的惡性程度及臨床預(yù)后有關(guān)。在惡性腫瘤的生長過程中，由于組織生長過快，必然造成組織嚴(yán)重缺氧。有研究報道，低氧可以促使肺組織中多種細(xì)胞合成分泌U-Ⅱ，低氧后血管巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增多，且細(xì)胞內(nèi)U-Ⅱ陽性反應(yīng)明顯增強(qiáng)，其分泌的U-Ⅱ亦可直接釋放入血，因此血管巨噬細(xì)胞合成的U-Ⅱ是循環(huán)中U-Ⅱ的重要來源［10］。而肺癌本身屬于缺氧腫瘤，隨著惡性程度的增高及病情進(jìn)展其缺氧程度加重，U-Ⅱ合成分泌亦增多，并可能通過旁分泌或自分泌的方式，作用于腫瘤細(xì)胞，直接或間接地維持和促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長，使癌細(xì)胞更有利于逃避免疫監(jiān)視，從而使腫瘤更具侵襲性，更容易發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但是U-Ⅱ在腫瘤的血管發(fā)生、發(fā)展過程中的機(jī)制，及其與其他影響因子之間的相互作用及具體作用機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究探討。

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劉振玉 E-mail:lzylzy660314@163.com

2011-03-03

2011-06-01）