系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞APO2.7的表達(dá)及意義

李 明 朱 蕓 馬晶晶 趙雪麗 (濰坊市人民醫(yī)院風(fēng)濕免疫科，濰坊261041)

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus，SLE)淋巴細(xì)胞的多克隆活化與淋巴細(xì)胞的凋亡紊亂密切相關(guān)。在細(xì)胞凋亡的調(diào)控系統(tǒng)中，線粒體膜蛋白的特異性抗體(APO2.7)是與Fas同族的膜蛋白，是凋亡細(xì)胞的一個(gè)早期反應(yīng)。本研究通過測定SLE患者不同時(shí)期外周血淋巴細(xì)胞APO2.7的表達(dá)，探討系統(tǒng)性紅斑狼瘡與淋巴細(xì)胞凋亡的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 SLE患者均為2003年6月～2009年3月本院住院病人，所有病例均符合1997年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)修訂的SLE分類診斷標(biāo)準(zhǔn)，以SLE疾病活動(dòng)評分(SLEDAI)判斷疾病的活動(dòng)度，SLEDAI≥8分為活動(dòng)期，＜8分為非活動(dòng)期。46例患者中女性38例，男性8例，年齡最大62歲，最小16歲，平均年齡(30.73±10.31)歲，活動(dòng)期31例，非活動(dòng)期15例，病程最長96個(gè)月，最短3個(gè)月。正常對照為門診體檢正常人群20名。經(jīng)詳細(xì)詢問病史及系統(tǒng)查體，排除可疑帶病者。兩組在性別和年齡構(gòu)成上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 研究方法

1.2.1 特殊試劑 藻紅蛋白(PE)標(biāo)記的鼠抗人APO2.7(APO2.7-PE);用于免疫陰性對照性的IgG1-PE均為美國Pharmingen生產(chǎn)的產(chǎn)品，由北京岳泰生物公司提供。淋巴細(xì)胞分離液由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究研所生產(chǎn)。

1.2.2 淋巴細(xì)胞的制備 取肝素抗凝血2 ml，重層于淋巴細(xì)胞分離液上，1 500 r/min，離心15分鐘，提取其中的淋巴細(xì)胞層，再用PBS洗脫2次，棄上清液備用。

1.2.3 免疫反應(yīng) 取2支試管各加待測的淋巴細(xì)胞懸液500 μl(細(xì)胞數(shù)為106ml-1)，其中的一支淋巴細(xì)胞懸液管加單抗工作液20 μl，另一支加陰性對照單抗IgG1-PE，避光反應(yīng)20分鐘，待測。

1.2.4 流式細(xì)胞儀(FACScan型，美國BD公司生產(chǎn))檢測 光源488 nm的氫離子激光，上機(jī)前以標(biāo)準(zhǔn)熒光微球調(diào)整儀器的變異系數(shù)并穩(wěn)定在2%以內(nèi)，上機(jī)后收集2萬個(gè)細(xì)胞，熒光強(qiáng)度以對數(shù)放大，光散射數(shù)據(jù)存盤，測試完后在Macintosh 650計(jì)算機(jī)上用CellQuest Plot軟件程序(美國BD公司提供)分析數(shù)據(jù)，以標(biāo)記陽性淋巴細(xì)胞百分率表示表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用SPSS11.0軟件處理，以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用Spearman分析，以P＜0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SLE患者外周血APO2.7的測定結(jié)果 46例SLE患者外周血APO2.7水平為(25.62±13.24)%，高于20例正常對照組(5.89±1.62)%(P＜0.05)。31例活動(dòng)期SLE患者外周血APO2.7水平為(58.71±24.41)%，15例穩(wěn)定期SLE患者外周血APO2.7水平為(12.22±6.44)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 外周血APO2.7水平與SLE患者SLEDAI評分、ESR、C3補(bǔ)體水平的相關(guān)性分析 46例SLE患者外周血APO2.7水平與ESR、IgG、SLEDAI評分呈正相關(guān)(r=0.581、0.577、0.552，P ＜ 0.05) ，與 C3補(bǔ)體水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.512，P＜0.05)。

3 討論

系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一種常見的自身免疫性疾病，主要免疫學(xué)特征是淋巴細(xì)胞的功能紊亂，已有研究發(fā)現(xiàn)，SLE的發(fā)生和發(fā)展可能與淋巴細(xì)胞凋亡有關(guān)，SLE患者淋巴細(xì)胞在組織培養(yǎng)中，其凋亡率明顯高于正常淋巴細(xì)胞[1，2]。細(xì)胞凋亡與SLE的關(guān)系國內(nèi)已多有報(bào)道，主要集中在Fas介導(dǎo)的凋亡機(jī)制研究方面，研究結(jié)果并不一致[3，4]。王曉樂等[5]研究發(fā)現(xiàn)SLE異常增高的IL-10促使 T細(xì)胞高表達(dá)FasL，誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞凋亡，參與了SLE的病理進(jìn)程，郝加虎等[6]發(fā)現(xiàn)SLE患者的PBMCs早期凋亡率顯著升高，且與患者的疾病活動(dòng)度和器官/系統(tǒng)損害程度相關(guān)。Dieker等[7]的研究顯示細(xì)胞凋亡在自身抗體特別是抗核小體生成過程中發(fā)揮了重要作用。

線粒體是細(xì)胞凋亡的中心環(huán)節(jié)，APO2.7分子量為38 000，是由Zhang等[8]首先報(bào)道的新的細(xì)胞凋亡標(biāo)志，有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，主要通過線粒體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡。APO2.7在凋亡檢測中極具前景，是凋亡細(xì)胞的一個(gè)早期反應(yīng)，早于細(xì)胞形態(tài)學(xué)和光學(xué)特性的變化。陳宏新等[9]研究提示APO2.7可能不是凋亡測定的特定標(biāo)志而是在細(xì)胞死亡(凋亡和壞死)過程中發(fā)揮作用。

目前，國內(nèi)對 APO2.7的研究不多，張璇等[10]檢測系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者外周血淋巴細(xì)胞APO2.7水平高于對照組。本資料發(fā)現(xiàn)SLE患者淋巴細(xì)胞APO2.7水平明顯高于正常組，且SLE活動(dòng)期較非活動(dòng)期高，而APO2.7表達(dá)率的增加導(dǎo)致了對其介導(dǎo)的凋亡的敏感性增加，從而可能引起淋巴細(xì)胞的凋亡率增高，提示SLE活動(dòng)期較非活動(dòng)期凋亡增加。傳統(tǒng)認(rèn)為藥物如糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，本組31例活動(dòng)期患者均在未接受任何藥物前收集血樣，所以活動(dòng)期患者凋亡增加，可以認(rèn)為與藥物無關(guān)，而與SLE患者淋巴細(xì)胞本身免疫異常有關(guān)。淋巴細(xì)胞凋亡在SLE發(fā)病中的作用十分復(fù)雜，彭春林等[11]研究揭示了外界環(huán)境和遺傳作用共同啟動(dòng)的細(xì)胞凋亡在SLE發(fā)病的作用。大體機(jī)制可能為:在特定外界刺激下，SLE患者本身免疫紊亂導(dǎo)致淋巴細(xì)胞凋亡增加，淋巴細(xì)胞在非正常凋亡過程中暴露產(chǎn)生各種細(xì)胞自身抗原片段，誘使多種自身抗體生成，如抗核小體抗體，從而加重自身免疫反應(yīng)，免疫狀態(tài)的混亂會(huì)啟動(dòng)新的細(xì)胞凋亡、炎癥的加重等多種病理過程。淋巴細(xì)胞APO2.7水平與SLE疾病活動(dòng)指數(shù)SLEDAI、ESR、IgG正相關(guān)，表明凋亡越明顯，病情越重，提示APO2.7與SLE的病情活動(dòng)密切相關(guān):凋亡早期APO2.7陽性表達(dá)率較顯著，可以預(yù)測早期細(xì)胞凋亡損傷的程度和估價(jià)預(yù)后。

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