豬瘟診斷的研究進展

魏 娟 孫保權(quán) 卜子俊

（1.江蘇省南京市六合區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所，南京 211500；

2.江蘇省南京市六合區(qū)第二畜牧獸醫(yī)站，南京 211500）

豬瘟（CSF）是的一種高度接觸性傳染病，由豬瘟病毒引起，以高熱稽留、出血和高死亡率為主要特征。呈以多發(fā)性出血為特征的敗血癥病變。慢性經(jīng)過的病例，主要是纖維素性壞死性腸炎，常伴有副傷寒及巴氏桿菌病繼發(fā)感染。由于廣泛使用豬瘟疫苗，近幾年來豬瘟發(fā)病呈非典型性發(fā)病。

目前，由于諸多原因致使CSF是成為嚴重威脅養(yǎng)豬業(yè)的疾病。雖然我國早就研制出很成熟的豬瘟兔化弱毒疫苗，但由于豬瘟的流行特征發(fā)生變化，發(fā)生免疫抑制和免疫失敗，感染豬瘟后也不出現(xiàn)明顯癥狀，但持續(xù)排毒，必須利用各種診斷技術(shù)對豬瘟的抗原變異性進行檢測。

2 病原體

豬瘟為單股正鏈RNA病毒。在病毒分類上屬黃病毒科（Flaviviridae）瘟病毒屬（Pestivirus）?；蚪M長12.3 KB，病毒子直徑40～50 nm，病毒囊膜有55和46KD兩種糖蛋白，核衣殼則為36KD蛋白質(zhì)構(gòu)成。豬瘟病毒與同屬的牛病毒性腹瀉病毒之間，基因組序列有高度同源性，抗原關(guān)系密切，存在交叉反應(yīng)。

3 診斷方法

3.1 實驗室常規(guī)診斷技術(shù)

3.1.1 免疫熒光試驗（FAT） 用熒光物質(zhì)標(biāo)記提純后的豬瘟病毒抗體IgG，再去著染豬病料（如病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎等）的冰凍切片或觸片，再在熒光顯微鏡下觀察組織細胞內(nèi)是否有亮綠色熒光。如果被觀察的組織細胞內(nèi)有亮綠色熒光，就說明被檢病料中有豬瘟病毒感染。否則，就是豬瘟陰性。

免疫熒光試驗結(jié)果直觀、可靠，是目前國內(nèi)外最常用的方法，它是Robertso于1965 年首次報道的。主要檢測病豬扁桃體、淋巴結(jié)、腎臟、脾臟等組織中的豬瘟病毒，在豬瘟病毒感染早期檢出率較高，還能檢出無明顯癥狀的帶毒母豬，并且可在12 小時內(nèi)判斷結(jié)果，既快速又準確，所以常用于病程初期診斷、檢疫及豬場進行豬瘟凈化。

3.1.2 血清學(xué)檢測方法 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）是世界動物衛(wèi)生組織推薦的豬瘟檢測方法?？刹捎瞄g接ELISA和夾心ELISA法進行檢測，主要用于檢測血清抗體和組織中病毒，其中，間接ELISA主要用于鑒別感染時會受免疫的干擾，而夾心ELISA則用于豬瘟病毒的初步定型，檢測豬脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、肺臟等組織中的病毒，能檢測出是否為豬瘟強毒感染，具有高度特異性和敏感性，而且它的試劑比較穩(wěn)定，操作簡單且無放射性危害。

3.2 分子生物學(xué)檢測技術(shù)

3.2.1 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR） 在豬瘟診斷中針對的對象是病毒的核酸，根據(jù)豬瘟病毒基因特定的序列，合成一對特異性引物，在引物的介導(dǎo)和反轉(zhuǎn)錄酶的催化下，合成RNA的互補鏈cDNA，加熱后cDNA與RNA鏈解離，然后與另一引物退火，并由DNA聚合酶催化引物延伸生成雙鏈靶DNA，最后擴增靶DNA，將擴增產(chǎn)物進行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色，在紫外燈照射下（254 nm）可見到特異擴增區(qū)帶。該方法適用于各種含毒病料的檢測，可用于臨床診斷，其操作簡單，并且特異性強、靈敏度高、重復(fù)性好，可快速檢測。

3.2.2 反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈式反應(yīng)(RT-nPCR) 使用2對聚合酶鏈式反應(yīng)引物擴增完整的片段。對組織材料、細胞或肉湯培養(yǎng)物中含量低的豬瘟病毒進行二次擴增，該方法能將我國流行的不同基因亞群的豬瘟病毒強毒與疫苗弱毒完全區(qū)分開來，且不與其他豬源病毒和牛病毒性腹瀉病病毒發(fā)生非特異反應(yīng)。可以較快對豬瘟做出準確診斷，并可將強毒感染豬迅速從弱毒疫苗免疫豬群中篩選出來，減少了未感染免疫豬被誤殺的可能性。

3.3.3 多重PCR(multiplex PCR)[2]指應(yīng)用多對引物同時擴增一個基因中的幾個不同DNA片段，或不同基因的幾個DNA片段。多重PCR中所設(shè)計的多對引物對必須有非常接近的退火溫度，如果2對引物間的Tm值相差懸殊，可引起擴增產(chǎn)物量的差別，常出現(xiàn)其中一個引物對無明顯的擴增產(chǎn)物。此外，靶基因DNA的擴增長度也必須相類似，否則較短的靶基因DNA的擴增效率明顯優(yōu)于擴增片段較長的DNA。因此，為了取得相同的擴增效率，必須調(diào)節(jié)各引物對之間的Tm值和PCR擴增產(chǎn)物的長度以及各引物對的量。該方法具有高效、經(jīng)濟簡便等特點，能夠快速、準確的診斷疾病，適合大量臨床樣品中病原體的快速診斷。

3.3.4 環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù) 日本學(xué)者Notomi 博士于2000 年建立了一種新穎的恒溫核酸擴增方法，即環(huán)介導(dǎo)等溫擴增法(loop-mediated isothermal amplification ， LAMP)[3]，其特點是針對靶基因的6 個區(qū)域設(shè)計4 種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase) 在等溫條件(65 ℃左右) 保溫幾十分鐘，即可完成核酸擴增反應(yīng)。不需要模板的熱變性、長時間溫度循環(huán)、繁瑣的電泳、紫外觀察等過程。LAMP 是一種嶄新的DNA 擴增方法，具有簡單、快速、特異性強的特點，具有替代PCR 方法的可能性。

3.3 基因芯片檢測技術(shù)

基因芯片（又稱DNA芯片）是近年來分子生物學(xué)與微電子學(xué)等多學(xué)科交叉融合而成的一項高新技術(shù)，其原型是20世紀80年代中期提出的?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進行核酸序列測定的方法，在一塊基片表面固定了序列已知的八核苷酸的探針。當(dāng)溶液中帶有熒光標(biāo)記的核酸序列TATGCAATCTAG，與基因芯片上對應(yīng)位置的核酸探針產(chǎn)生互補匹配時，通過確定熒光強度最強的探針位置，獲得一組序列完全互補的探針序列。據(jù)此可重組出靶核酸的序列?；蛐酒夹g(shù)為豬瘟診斷技術(shù)提供了新的技術(shù)理念，目前已經(jīng)正進行這方面的研究，其研究成果將對我國豬瘟的防控具有深遠意義。

[1] 李艷，仇華吉，王秀榮，等.鑒別豬瘟強毒和弱毒的反轉(zhuǎn)錄-復(fù)合套式聚合酶鏈式反應(yīng)（RT-PCR）檢測方法的建立[J]. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2006， 39 (9): 1907-1914.

[2] 謝玉潔. PRRS、PCVD和CSF 病毒多重PCR方法的建立及其應(yīng)用研究[D]. 合肥: 安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2008