一株鴿新城疫病毒的分離鑒定

范建華 劉華雷 劉學(xué)賢 徐 步*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，揚(yáng)州 225003；2.中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心，青島 266032）

鴿新城疫又稱鴿I型副粘病毒病（PPMV-1），是目前危害我國(guó)養(yǎng)鴿業(yè)的一個(gè)主要烈性傳染病。發(fā)病鴿多見(jiàn)于25～50日齡的青年鴿，以拉綠色糞便、扭頭、翅膀下垂等為主要臨床表現(xiàn)。發(fā)病率可高至70%。急性發(fā)病期，如果有其他細(xì)菌性疾病和寄生蟲(chóng)病伴發(fā)，死亡率可達(dá)到30%。本實(shí)驗(yàn)主要針對(duì)江蘇省某規(guī)?；潏?chǎng)的發(fā)病情況，及時(shí)采取病死鴿的腦、脾臟等組織進(jìn)行了病毒分離和鑒定，以及相關(guān)的生物學(xué)特性研究，旨在探明該鴿場(chǎng)鴿病發(fā)生原因，進(jìn)一步了解鴿新城疫的發(fā)病機(jī)理和尋求防控策略。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.2 試驗(yàn)雞和雞胚 SPF雞胚購(gòu)自山東家禽所，SPF雛雞在中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心孵化、飼養(yǎng)。

1.1.3 標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 NDV、AIVH5、H9和EDSV標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，均購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.1.4 試驗(yàn)用菌株和質(zhì)粒 E．coli DH5α和pGEM-T Easy載體均由中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心提供。

1.1.5 試驗(yàn)用試劑 RNA提取試劑盒、RT-PCR 試劑盒、質(zhì)粒抽提試劑盒、DNA凝膠純化試劑盒IPTG、X-gal、RNA 酶抑制劑、EcoR I和DNA Marker DL2000、氨芐青霉素和DEPC均購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 病毒分離、噬斑純化 參照文獻(xiàn)[4]方法進(jìn)行。

1.2.2 血清學(xué)鑒定 用β-半數(shù)微量法測(cè)定尿囊液HA效價(jià)，用NDV、H5、H9、EDS-76標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清進(jìn)行HI試驗(yàn)。

1.2.3 病毒毒力測(cè)定 MDT和ICPI測(cè)定：參照《中華人民共和國(guó)出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》(SN/T111022002) 規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行。

1.2.4 引物設(shè)計(jì)、合成和基因測(cè)序 根據(jù)GenBank上已發(fā)表的NDV F基因全基因序列，利用primer 5.0軟件自行設(shè)計(jì)了引物，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，序列為：P1：5′-ATGGGCYCCAGAYCTTCTAC-3′，P2：5′-CTGCCACTGCTAGTTGTGATAATCC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)常規(guī)方法連接、轉(zhuǎn)化、鑒定后測(cè)序。

1.2.5 同源性比較和進(jìn)化樹(shù)分析 利用MEGA4.0軟件對(duì)所測(cè)序列和GenBank上已公布的NDV毒株序列進(jìn)行比較，根據(jù)F基因ORF 1-389nt之間的核苷酸序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)和基因分型，并分析裂解位點(diǎn)的氨基酸組成。

2 結(jié)果

2.1 病毒分離、純化結(jié)果

病毒接種SPF雞胚，48h以后全部出現(xiàn)死亡，死亡雞胚胚體均表現(xiàn)彌漫性出血，尤以胚的頭部、肝臟和腎臟出血嚴(yán)重；病毒前2代細(xì)胞噬斑出現(xiàn)時(shí)間、大小不一，到第3代以后噬斑出現(xiàn)時(shí)間是48h以內(nèi)，大小較均勻。

2.2 血清學(xué)鑒定結(jié)果

病毒連續(xù)傳至第3代以后，HA效價(jià)穩(wěn)定在在8㏒2以上；HI試驗(yàn)表明，該分離病毒的紅細(xì)胞凝集性可被NDV抗血清抑制， AIVH5、AIVH9及EDS-76陽(yáng)性血清表現(xiàn)陰性，初步鑒定為新城疫病毒感染。

2.3 病毒毒力測(cè)定結(jié)果

2.3.1 MDT測(cè)定結(jié)果 取10-6～10-9稀釋度分離、純化的病毒，每個(gè)稀釋度接種5只10日齡SPF雞胚，0.1 ml/只，照蛋3次/d，間隔8h，共觀察7d，記錄雞胚死亡時(shí)間，結(jié)果詳見(jiàn)表1。結(jié)果表明，引起雞胚死亡的最高稀釋度(MLD)在10-7，計(jì)算得MDT為129.6h。

表1 SPF 雞胚接毒后死亡情況

2.3.2 ICPI測(cè)定結(jié)果 取1日齡雛雞10只，各腦內(nèi)注射10-1稀釋度的純化尿囊液0.05 ml。另取2只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.05 ml。接種后，每天在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察，記錄雛雞的情況，分正常（活動(dòng)靈活，行動(dòng)無(wú)共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象）、發(fā)?。ò楸浴⑴P地不起，但不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞）和死亡。觀察8d（結(jié)果見(jiàn)表2），計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值（正常為0、發(fā)病為1，死亡為2），累計(jì)總分?jǐn)?shù)，計(jì)算得ICPI為0.287。

表2 1日齡SPF雞腦內(nèi)接種后發(fā)病情況

2.4 F基因測(cè)序結(jié)果

經(jīng)一步法RT-PCR，獲得1條約500bp的特異性擴(kuò)增條帶，與預(yù)期擴(kuò)增的目的片段大小相符(見(jiàn)圖1) 。應(yīng)用MEGA4.0軟件分析測(cè)序結(jié)果，推導(dǎo)其氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)該毒株F基因裂解位點(diǎn)氨基酸序列為112R-R-Q-K-R-F117，與NDV強(qiáng)毒株的特征性結(jié)構(gòu)相符。

圖1 NDV F 基因的RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物

2.5 同源性分析結(jié)果

應(yīng)用MEGA4.0軟件，將P3株與GenBank中已公布的具有代表性的NDV毒株F基因ORF 1-389nt之間核苷酸進(jìn)行同源性比較分析，結(jié)果見(jiàn)表3。其中，與Lasota株的同源性最高，核苷酸序列同源性達(dá)99.9%，轉(zhuǎn)譯氨基酸的同源性達(dá)100%；與Kuwait 256株的同源性最低，核苷酸序列同源性達(dá)86.3%，轉(zhuǎn)譯氨基酸的同源性達(dá)84.1%。

表3 P3株與GenBank中部分已公布的NDV代表株F基因核苷酸和氨基酸的同源性比較

2.6 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

根據(jù)F基因ORF的1-389bp序列，應(yīng)用MEGA4.0軟件對(duì)GenBank中已公布的NDV毒株與本實(shí)驗(yàn)分離毒株的F基因進(jìn)行序列比對(duì)分析，繪制了系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖2)。本實(shí)驗(yàn)分離株在分類地位上屬于基因II型。

圖2 新城疫F基因片段（389bp）遺傳進(jìn)化樹(shù)（注：本實(shí)驗(yàn)中的分離株用▲標(biāo)出）

3 討論與分析

（1）鴿新城疫是鴿子常見(jiàn)的病毒性疾病之一。我國(guó)自1981年廣東省拱北首例鴿新城疫發(fā)生以來(lái)，該病很快傳播至東南沿海城市。近年來(lái)，我國(guó)內(nèi)陸城市和地區(qū)也陸續(xù)有鴿新城疫的病例報(bào)道。江蘇省是鴿業(yè)養(yǎng)殖的一個(gè)重要省份，隨著養(yǎng)殖規(guī)模化，鴿新城疫屢有發(fā)生。本實(shí)驗(yàn)所用的鴿新城疫病毒是從江蘇省內(nèi)某規(guī)?；怿潏?chǎng)分離。該鴿場(chǎng)共有10棚青年鴿，自發(fā)病以來(lái)，發(fā)病率和死亡率急劇上升。筆者結(jié)合常規(guī)血清學(xué)方法和分子生物學(xué)手段確診該病例為鴿新城疫弱毒株感染，從分類地位上屬于基因型Ⅱ型，從核苷酸和轉(zhuǎn)譯氨基酸組成來(lái)看與傳統(tǒng)LaSota株的同源性最高，與Kuwait256株同源性最低，這可能與該分離病毒的始原和傳代次數(shù)有關(guān)。但從MDT和ICPI的測(cè)定數(shù)據(jù)，以及F基因序列特征結(jié)構(gòu)等來(lái)看，不能確定其為L(zhǎng)aSota疫苗株的變異，這與有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道不一。

（2）早在1978年鴿新城疫首次發(fā)生以來(lái)，Collins[1]等人就認(rèn)為鴿新城疫的毒力和致病性與F基因序列特征結(jié)構(gòu)相關(guān)，但近年來(lái)的爭(zhēng)議較多。Pearson[3]等從鴿分離的10株新城疫病毒進(jìn)行毒力型測(cè)定時(shí)，發(fā)現(xiàn)這10株鴿分離物至少相當(dāng)于雞新城疫中的中發(fā)型毒株，但其最小致死量致死雞胚的平均死亡時(shí)間(MDT)最低值為98h，與雞的中發(fā)型毒株的MDT小于90h又表現(xiàn)出不一致。而且，這幾株分離物通過(guò)泄殖腔、鼻腔或肌肉注射時(shí)不使雞發(fā)??；J. C. F. M. Dortmans[11]等構(gòu)建了1株P(guān)PMV-1，標(biāo)號(hào)為AV324。然而AV324株對(duì)雞沒(méi)有致病性，但其F基因轉(zhuǎn)譯氨基酸的組成具備典型的強(qiáng)毒株特征性結(jié)構(gòu)，即“112RRKKRF117。本實(shí)驗(yàn)分離株，MDT＞90h，ICPI ＜0.5，符合弱毒株的特征性結(jié)構(gòu)，而F基因轉(zhuǎn)譯氨基酸的組成（112R-R-QK-R-F117）又符合強(qiáng)毒株特征。因此，鴿新城疫的毒力和致病性不能完全由新城疫的F基因裂解位點(diǎn)的特征性結(jié)構(gòu)決定。

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