B細胞BCRCDR3受體庫的高通量測序分析概況①

王小妹 王 鵬 綜述 姚新生 審校

(遵義醫(yī)學院免疫學教研室貴州省免疫學研究生教育創(chuàng)新基地,遵義563003)

B細胞是介導機體體液免疫應答的主要細胞群,其識別、結合抗原主要依賴互補決定區(qū)(CDR),它決定著抗體的特異性,而互補決定區(qū)3(CDR3)比CDR1、CDR2更具多樣性[1],通過觀察機體 B細胞BCRCDR3受體庫的多樣性、重疊率的大小、CDR3區(qū)的基因/氨基酸組成特征、各亞家族的偏向取用等,可以觀察生理及病理狀態(tài)下機體免疫的相關情況。高通量測序能對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行全貌、細致的分析,目前在國外已開展并應用于B細胞BCRCDR3受體庫測序。

1 B細胞BCRCDR3受體庫概述

機體體液免疫應答主要由B細胞介導,其通過產(chǎn)生特異性抗體來應答抗原,對機體起重要保護作用。B細胞識別抗原主要依賴BCR,BCR是由兩條重鏈(H)和兩條輕鏈(κ或λ)組成的四聚體,其可變區(qū)和恒定區(qū)分別由不同染色體上的多個不連續(xù)基因片段重排所編碼。人的κ鏈(2p11.2)和λ鏈(22q11.2)由“Vn-Jn-C”基因重排形成,H 鏈(14q32.33)由“Vn-Dn-Jn-Cn”基因重排形成,其可變區(qū)包含三個高變區(qū),分別為 :CDR1、CDR2、CDR3,而決定 B 細胞識別抗原肽的關鍵部位是最具多樣性的重鏈CDR3區(qū),其由“IGHV(51個功能性基因片段)末端-IGHD(23個功能性基因片段)--IGHJ前端(6個功能性基因片段)”(http://www.imgt.org/IMGT-GENE-DB/GENElect?livret=0)基因重排及“V—D”和“D—J”連接時中間插入或剪接的核苷酸序列組成,類型轉(zhuǎn)換和體細胞高頻突變都能促成其多樣性形成[2](單個人由于重鏈、輕鏈本身的多樣性及重、輕鏈配對組合的多樣性至少能形成1011種以上B細胞受體)[3]。由于其驚人的多樣性,正常機體幾乎能對所有侵入機體的異物產(chǎn)生應答[4]。每種克隆B細胞BCR有著特定CDR3序列組成,當抗原進入機體,就會引起其特異性B細胞克隆擴增并產(chǎn)生相應抗體對抗原應答。由于B細胞BCRCDR3區(qū)是B細胞識別抗原的主要部位,其長度及多樣性都會影響它對抗原的識別與親和力,故B細胞的特異性可以認為是基因重組和體細胞高頻突變形成特異CDR3的結果,CDR3序列多變的特征為抗原的選擇提供一個多樣化的B細胞受體庫。通過分析B細胞BCRCDR3受體庫,能為監(jiān)測和分析生理及病理狀態(tài)下機體的免疫狀況及B細胞的發(fā)生、發(fā)展機制提供新思路、新方法和手段。

2 B細胞BCRCDR3受體庫的監(jiān)測方法

B細胞BCRCDR3受體庫相關研究方法眾多,如聚合酶鏈反應(PCR)-單鏈構象多態(tài)性分析(SSCP)[5]是利用DNA或RNA單鏈構象具有多態(tài)性的特點,結合PCR技術進行基因檢測的一種分析技術。利用聚丙烯酰胺電泳或毛細管電泳技術將PCR擴增片段按序列大小分離,出現(xiàn)單一條帶考慮為含相應V基因家族的B細胞存在單克隆重排。但此方法存在操作繁瑣,且只能對序列突變進行初步分析,不能觀察到序列的具體堿基組成及突變點的問題。隨著核酸末端標記技術的發(fā)展,用“免疫譜型分析技術(Immunespectratyping)”[6-8](或“免疫掃描(指紋)技術(Immunoscope))來研究CDR3序列得到較為廣泛的應用,通過在上游或下游引物的5′端標記FAM等熒光素,利用測序膠掃描技術(GeneScan等軟件)、毛細管電泳技術(PeakScan等軟件)分析CDR3區(qū)的PCR擴增產(chǎn)物各V基因家族序列的長度和多、寡、單克隆偏向性,來判斷所代表的相應T&B細胞的增生情況。這種基于分析CDR3區(qū)長度和多態(tài)性的技術自上世紀90年代初應用以來,推動了TCR&BCRCDR3受體庫在多種生理和病理狀態(tài)下的基礎和應用研究。該方法能很好地觀察到CDR3譜系漂移,結合測序還能觀察到部分序列組成,但成本高、操作復雜。另外,基于對相應探針進行各種標記(同位素、熒光素等),用核酸雜交技術[9,10]分析相應V或J基因家族組成的CDR3序列的表達頻率等方法在T&B細胞受體庫研究中得到較廣的應用。

上述方法均只能粗略地對序列多樣性程度及高變區(qū)長度多態(tài)性分布或部分序列組成進行分析,所獲數(shù)據(jù)局限且易出現(xiàn)偏差,要深入且動態(tài)地監(jiān)測CDR3譜型,快速、全面觀察個體B細胞BCR CDR3受體庫序列的組成和特征,以及個體間的重疊率,研究其與疾病或與疾病活動情況的關聯(lián);對比分析同一疾病患者B細胞BCR CDR3受體庫;比較患有某疾病的個體與正常個體B細胞BCR CDR3受體庫的差異等問題,尚待進一步在基因水平對B細胞受體庫進行深入研究。

隨著分子生物學的發(fā)展和人類基因組計劃的順利實施,基因診斷已逐漸進入臨床實驗室,成為臨床檢驗的常規(guī)項目,其中DNA測序是基因診斷的金標準。DNA測序技術自發(fā)明以來一直在推動分子生物學發(fā)展方面起著至關重要的作用,它從根本上改變了人們研究所有生命藍圖的方式,并且推動了基因組學及其分支乃至其他密切相關學科的創(chuàng)立與發(fā)展,如生物信息學,系統(tǒng)信息學,基因組學及合成生物學等。DNA測序技術的進展使生命研究的基本元素發(fā)生了轉(zhuǎn)變,從單一、局部的基因或基因片段轉(zhuǎn)變成整個基因組,要大批量、準確的檢測序列組成變化需應用近年發(fā)展起來的高通量測序技術。

高通量測序技術又稱“下一代測序技術”或“深度測序”或“第二代測序技術”,是對傳統(tǒng)測序的一次革命性改變,一次能對幾十萬到幾百萬DNA分子進行序列測定,使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行全貌、細致的分析成為可能。高通量測序中三種代表性的第二代測序技術為Roche 454、Illumina Genome Analyzer、ABI SOLiD sequencer,羅氏公司的454測序儀(Roche GS FLX sequencer,http://www.454.com)是世界上第一個可以提供超高通量基因組和長片段DNA測序的商業(yè)化系統(tǒng)設備。該系統(tǒng)采用一種基于焦磷酸測序原理而建立起來的高通量基因組測序技術,通過納米技術、微流體技術和微陣列技術的結合,拼接超高通量的DNA片段得到完整的基因組。其每個反應可以得到100萬個以上序列讀長,序列平均讀長可達450 bp,每天可以產(chǎn)出1億個以上堿基數(shù)據(jù);同時,Roche于2010年推出了精巧型高通量基因組測序儀“Roche GSJunior”,平均每次運行可獲10萬個400 bp左右的序列,有很大的推廣應用價值;Illumina公司的Solexa基因組分析儀(Illumina Genome Analyzer,http://www.illumina.com.cn,將“合成測序”化學法與“DNA簇技術”相結合),于2010年推出的HiSeq 2000系統(tǒng),它每天的測序通量高達25 Gb,單個讀長達到100 bp;ABI的SOLiD測序儀(ABISOLiD sequencer,http://www.appliedbiosystems.com.cn/,基于序列連接的化學法),在2010年推出的SOLiD 5500xl每天的測序通量高達30 Gb,單個讀長為75 bp。這些測序方法能大大縮短測序的時間,使得對一個物種的基因組進行細致、全貌的分析成為可能。最適合CDR3受體庫分析的是Roche 454高通量測序技術,因為其測序讀長為450 bp左右,而目前CDR3受體庫的制備,最優(yōu)化和簡便的是在V區(qū)設計上游引物,在C區(qū)設計下游引物,擴增CDR3受體庫的PCR產(chǎn)物在400 bp左右,用Roche 454高通量測序儀單向測序便能完整的測出PCR產(chǎn)物的全長,并直接的進行分析。而Illumina Genome-Analyzer、ABI SOLiD sequencer因讀長有限,需要對CDR3受體庫的制備進行多次的優(yōu)化;同時,測序時需進行雙向測序和數(shù)據(jù)對接。

高通量測序是一種高效、準確、靈敏度高、自動化的基因測序方法,它主要是應用特異性引物擴增目標序列,將擴增產(chǎn)物電泳,對目的區(qū)有條帶者進行測序。不同于常規(guī)引物,如在B細胞BCR CDR3受體庫的監(jiān)測中,以cDNA為模板,再根據(jù)基因特點,將IGHV分為六個家族,并設計六條上游引物(包括90%以上V區(qū)基因);依據(jù)IgM、IgG、IgA序列設計三條下游引物,并根據(jù)個體的不同加上不同“標簽”(由10個特異性堿基序列組成),此即特異性引物。每個個體的PCR擴增產(chǎn)物序列都帶有特異性標記,經(jīng)電泳、膠回收、純化后,所有樣本產(chǎn)物就能作為一個樣本進行反應測序。分析結果時可根據(jù)特異性標記區(qū)分樣本。高通量測序簡化了樣本準備步驟(測序前僅需把樣本進行PCR擴增),縮小了反應體系,節(jié)約了試劑,現(xiàn)在國外已將其初步應用于T、B細胞序列分析[2-4,11-15]。

3 B細胞BCR CDR3受體庫的分析

3.1 生理狀態(tài)下B細胞BCRCDR3受體庫的分析每個個體的BCR CDR3受體庫中存在一定數(shù)量、多樣性的CDR3序列,那么不同個體該庫的大小、多樣性會一致嗎?并且,由于遺傳基因和所處環(huán)境差異,每個個體都存在獨特性B細胞BCRCDR3序列,那么獨特性B細胞BCR CDR3受體庫在個體間的分布是怎樣的呢?個體間的CDR3受體庫的重疊率是怎樣的呢?受體庫的大小和多樣性會隨年齡變化嗎?這些問題都仍待解決。同時,對一些分化來源存在爭議的B細胞亞群也可以通過分析它們的BCR CDR3序列用以鑒定,如Wu等[2]通過Roche 454高通量測序技術檢測B細胞受體庫,分析了轉(zhuǎn)換后記憶B細胞和IgM記憶B細胞的關系。對于IgM記憶B細胞的來源一直有爭議,主要有三種假設:首先,有研究者認為其是胸腺依賴性抗原刺激產(chǎn)生的生發(fā)中心中還未經(jīng)歷類型轉(zhuǎn)換的記憶細胞,因為有報道稱高頻突變先于類型轉(zhuǎn)換,且這兩個過程是可以分開的;另有研究者認為其可能是來自胸腺非依賴性抗原刺激產(chǎn)生的生發(fā)中心形成的,因為IgM記憶B細胞在機體應答胸腺非依賴性抗原中發(fā)揮重要作用;還有研究者認為該記憶B細胞不需要抗原刺激即存在,因為在胎兒中即發(fā)現(xiàn)有該種細胞存在。通過分析發(fā)現(xiàn),這兩種細胞受體庫有較大差異,IgM記憶細胞比轉(zhuǎn)換后記憶B細胞IGHV1取用率下降而高取用了IGHV3,序列中帶負電及脂肪族氨基酸含量較少,故認為IgM記憶B細胞和轉(zhuǎn)換后記憶B細胞來源不盡相同,IgM記憶B細胞可能來源眾多。另有研究應用Roche 454高通量測序分析四種不同家族的14條斑馬魚的抗體庫(IgM和IgZ)[15]。斑馬魚是進化過程中具有最早可識別的適應性免疫系統(tǒng)的物種,并且與人的基本組成類似,它也取用重組活化基因(RAG)和V、D、J重組以產(chǎn)生抗體,但斑馬魚免疫系統(tǒng)僅含約300 000個能產(chǎn)生抗體的B細胞,比人類要簡單5個數(shù)量級。每條魚檢測到28 000～112 000條有效序列(分辨出V、D、J的取用,正確率達98%),斑馬魚的VDJ庫理論上為975種(39V*5D*5J),則在每條被研究的斑馬魚中,VDJ庫的覆蓋率達50%～86%。并且每個個體的VDJ庫及抗體重鏈的多樣性分布相似,不同個體有相同IgH鏈取用趨勢,甚至有兩個個體共同取用245種序列,有5個個體共同取用2種序列;同一家族部分個體間VDJ取用具高相關性。Boyd等[4]通過454高通量測序?qū)?2個人的B細胞受體庫分析,檢測到108210條IgH重組序列并確定了它們的基因型。已報告功能性IGHV基因及其等位基因的多樣性為45～60種,由于基因雜合的多樣性水平,研究者發(fā)現(xiàn)了之前未報告過的 14種 IGHV多態(tài)性,并且 IGHD3-16、IGHJ6基因的多態(tài)性也被發(fā)現(xiàn);還確證了IGHV3-33*05、IGHV3-66*02和 IGHV4-31*01等9種基因是存在的,并質(zhì)疑 IGHJ3*01、IGHJ4*01、IGHJ5*01和IGHJ6*01等位基因是否報告錯誤,與其它報告一致[16]。而Glanville等[3]采用454高通量測序?qū)?54個樣本的B細胞受體庫進行分析,發(fā)現(xiàn)重鏈CDR3區(qū)長度為1～31個氨基酸,服從正態(tài)分布,在其大部分位點,每種氨基酸都有分布;CDR1和CDR2都具有一定的多樣性,這種多樣性主要來自種系基因多態(tài)性和高頻突變,并且重、輕鏈的隨機配對也能產(chǎn)生部分多樣性(48H*53L=2544)。另外,有研究發(fā)現(xiàn)機體T細胞TCR CDR3序列V、D、J各家族的取用有非隨機現(xiàn)象[17],那么在B細胞受體庫中各家族的取用是否隨機呢?現(xiàn)在B細胞BCR CDR3受體庫數(shù)據(jù)尚不完善,隨技術改革,通過進一步分析,將識別低頻出現(xiàn)在群體中的等位基因,觀察到不常見的重組序列,或能觀察到更多基因多態(tài)性與疾病的關聯(lián)。

疫苗接種是目前預防疾病的最好方法之一,已開發(fā)了多種類型疫苗,如基因工程疫苗、亞單位疫苗、合成肽疫苗等,廣泛應用于預防乙肝、狂犬病、白喉等疾病。但接種后效果的檢測目前僅停留在蛋白水平,對于在基因水平動態(tài)監(jiān)測和分析抗體的發(fā)生與發(fā)展仍待進一步探索。B細胞受體對抗原應答主要依賴其CDR3區(qū)識別抗原表面分子,一種表面分子能與所有B細胞受體的CDR3區(qū)結合的幾率非常低,最后與該表面分子具最適親和力的B細胞會產(chǎn)生活化與應答[18,19]。如通過動態(tài)觀察B細胞BCR CDR3受體庫可在基因水平觀測機體針對某疫苗的免疫應答情況,并能對其主要受體序列進行分析,還能為某些仍缺乏良好免疫效果疫苗的疾病開發(fā)新型疫苗提供新思路。單克隆抗體現(xiàn)廣泛用于檢驗醫(yī)學診斷試劑盒、腫瘤的導向治療和放射免疫顯像技術等方面,但傳統(tǒng)的方法如單細胞 PCR擴增V區(qū)[20,21]、用 EB病毒或逆轉(zhuǎn)錄病毒調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄[22]、分析和掃描重組抗體庫[23],都依賴復雜而精確度不高的掃描技術。Reddy等[13]通過454高通量測序分析免疫后鼠的B細胞受體庫,挑出頻率較高的重鏈和輕鏈序列,將其自動化基因合成并連接到細菌等載體上,從而無需掃描即能生產(chǎn)單克隆抗體。

3.2 B細胞BCRCDR3受體庫分析與疾病的預測、診斷和預后 B細胞是機體免疫應答的主要細胞群,當某些對機體具重要免疫保護效應的BCR CDR3序列缺失時會引起機體易患某些疾病。如有研究者發(fā)現(xiàn)一無明顯癥狀的貧血患者體內(nèi)染色體有六種IGHD基因缺失,這就影響了B細胞受體的多樣性表達,進而影響了機體的免疫功能[4]。是否是由于這種缺失引起了無癥狀貧血仍待進一步探索,但為研究貧血的發(fā)病機制提供了新思路,并可推測通過大范圍對B細胞受體基因進行分析,或發(fā)現(xiàn)某些基因位點與疾病存在關聯(lián),研究還發(fā)現(xiàn)在某些惡性疾病癥狀出現(xiàn)之前,檢測機體B細胞BCR CDR3受體庫能發(fā)現(xiàn)其序列具單、寡克隆現(xiàn)象,能為疾病的預防和早期診斷提供重要信息[11];并且通過克隆情況可對機體腫瘤同源性進行分析:對一淋巴瘤患者的B細胞BCR CDR3受體庫分析發(fā)現(xiàn)存在兩群非同源的B細胞克隆,后經(jīng)復雜的形態(tài)學和免疫組化等實驗證實該患者確實患有兩種不同淋巴瘤。在自身免疫性疾病的應用研究中Klarenbeek等[24]在最近的一次國際會議上,報告了用高通量測序T&B細胞CDR3受體庫在類風濕性關節(jié)炎的發(fā)病機制和診療上的研究價值和意義。隨研究的深入,將會發(fā)現(xiàn)更多基因多態(tài)性與疾病的關聯(lián);并且,更深入的對B細胞BCRCDR3受體庫進行分析在觀察某些疾病治療效果方面也將成為很好的指標。如通過分析造血干細胞移植前后BCR CDR3受體庫的大小及多樣性變化,能深入、準確的監(jiān)測機體免疫重建狀況;某些B細胞發(fā)生、發(fā)展存在障礙的個體用藥治療時,通過動態(tài)監(jiān)測其BCR CDR3受體庫,可觀察該藥物的療效;某些疾病治療后仍有微小殘留病灶但無明顯表征,用常規(guī)方法不容易檢出,但可通過分析 BCR CDR3受體庫觀察到單、寡克隆擴增。Boyd等[11]將454高通量測序技術應用到惡性疾病的評估、監(jiān)測疾病殘存病灶、不同年齡健康個體克隆多樣性分析等方面。如對治療后慢性淋巴細胞白血病患者B細胞受體庫用454高通量測序和克隆特異性實時PCR兩種方法進行監(jiān)測,以觀察是否存有微小殘余病灶,結果顯示兩種方法具有良好一致性;文中提出用454高通量測序僅需不到0.1 ml的血樣足以用于觀察機體多樣性克隆情況,并指出通過該種測序能清晰地監(jiān)測到B細胞受體庫中VDJ優(yōu)先重組情況,如在該次研究中即發(fā)現(xiàn)D2-2與J6、D3-22與J3、D3-3與J6等有優(yōu)先配對現(xiàn)象;文中還強調(diào)某些克隆比例增多,可能是機體對抗原的應答反應,也可能是細胞惡化的前期標志;在分析某些淋巴瘤(尤其是經(jīng)歷了高頻突變的毛囊瘤)的B細胞受體庫時要注意引物的設計,以防影響結果。故監(jiān)測B細胞BCR CDR3受體庫的分析方法不失為應用于臨床篩查、診斷疾病及觀察其治療療效并應用于指導個性化治療等方面的簡便、靈敏、準確的好方法。

4 小結

綜上所述,B細胞BCR CDR3受體庫隨著其監(jiān)測技術的進步,容量和準確度都在不斷提升、完善。分析機體B細胞BCR CDR3受體庫的應用前景廣闊,貫穿生理和病理相關研究,為當前某些無法解決的問題提供了新思路。如B細胞發(fā)生、發(fā)展機制的深入研究;某些疾病(如系統(tǒng)性紅斑狼瘡)的發(fā)病機制及早期監(jiān)測與診斷的探討等。隨DNA測序技術的發(fā)展,Roche 454技術為B細胞BCR CDR3受體庫的分析應用與研究建立了良好的技術平臺。相信隨著研究的深入,分析B細胞BCR CDR3受體庫的作用會日益凸顯,或?qū)糜谂R床疾病篩查、診斷、治療、藥物療效觀察等方面。

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