實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人獸共患傳染病

夏咸柱，高玉偉，王化磊

（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130122）

1 人獸共患傳染病的形勢(shì)嚴(yán)峻

人獸共患病是指在脊椎動(dòng)物與人類之間自然傳播的疾病和感染，即脊椎動(dòng)物和人類由共同病原體引起的，在流行病學(xué)上有相互關(guān)聯(lián)的疾病。在WHO所分類的1415種人類疾病中，有61％屬于人獸共患病。在人類所知的300多種傳染病中，除十余種只感染人類之外，其余的都是人獸共患傳染病。近年發(fā)生的175種新發(fā)傳染病中，有132種是人獸共患傳染病，占75.4％。人獸共患傳染病曾給人類造成了巨大的危害。1333年黑死?。ㄊ笠撸┧僚埃瑑H在歐洲就造成2000萬(wàn)人死亡；1918年的“西班牙流感”在不到一年的時(shí)間內(nèi)傳遍世界，導(dǎo)致5000萬(wàn)人死亡；1957年“亞洲流感”導(dǎo)致100萬(wàn)人死亡；1981年發(fā)現(xiàn)首例AIDS病人，目前在全球已造成3000萬(wàn)人死亡；2003年30余個(gè)國(guó)家和地區(qū)暴發(fā)SARS，導(dǎo)致8437人發(fā)病，813人死亡；2003年再度發(fā)生的人禽流感導(dǎo)致564人發(fā)病，330人死亡（截止2011年8月9日），病死率近60％。

當(dāng)前人獸共患傳染病的防控形勢(shì)十分嚴(yán)峻。一方面，新發(fā)與烈性人獸共患傳染病如SARS、禽流感、甲型H1N1流感、病毒性出血熱等疫情不期而至，近年來(lái)幾乎每1～2年就會(huì)出現(xiàn)一種全球性流行的新發(fā)傳染病。另一方面，曾經(jīng)嚴(yán)重威脅人類健康的炭疽、鼠疫、狂犬病、結(jié)核病、布魯氏桿菌病等時(shí)有死灰復(fù)燃。如何有效預(yù)防、控制和消滅人獸共患傳染病已成全人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是人獸共患傳染病防控重要支撐條件

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是指以科學(xué)實(shí)驗(yàn)為目的，經(jīng)人工飼養(yǎng)、繁殖，對(duì)其攜帶的微生物或寄生蟲進(jìn)行控制，遺傳背景明確、來(lái)源清楚，而應(yīng)用于科學(xué)研究、教學(xué)、生產(chǎn)和鑒定以及其他科學(xué)試驗(yàn)的動(dòng)物。人們預(yù)測(cè)以生命科學(xué)為基礎(chǔ)的第六次科技革命將來(lái)臨，而實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是生命科學(xué)研究的基礎(chǔ)和重要支撐條件。生命科學(xué)的支撐條件可概括為AEIR要素：animal（實(shí)驗(yàn)動(dòng)物）；equipment（儀器設(shè)備）；information（信息）；reagent（試劑）。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物居于生命科學(xué)研究四大支撐條件之首，足見(jiàn)其在生命科學(xué)研究中的重要性。很多重要的科研成果來(lái)源于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物起著“活的天平”和“活的化學(xué)試劑”的作用。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已被廣泛用于科學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域，尤其在生物醫(yī)學(xué)研究中更是非常重要的支撐條件。同樣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物也是人獸共患傳染病研究的重要支撐條件。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在人獸共患傳染病防控研究中的應(yīng)用

作為支撐條件的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在人獸共患病防控研究中應(yīng)用頗為廣泛，包括病原分離、感染與發(fā)病機(jī)制研究、藥物篩選與評(píng)價(jià)、疫苗研制與評(píng)價(jià)、診斷用品制備等諸多方面。人獸共患傳染病種類較多，病原體復(fù)雜多樣，需要有針對(duì)性的開(kāi)展防控研究。我國(guó)農(nóng)業(yè)部在2009年1月19日會(huì)同衛(wèi)生部發(fā)布了《人獸共患傳染病名錄》。名錄包含26種傳染病，其中收錄了3種病毒性傳染病，為高致病性禽流感、狂犬病和豬乙型腦炎。本文重點(diǎn)介紹實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在流感和狂犬病防控研究中的應(yīng)用。

3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感防控研究中的應(yīng)用

A型流感病毒包括16個(gè)血凝素亞型（HA）和9個(gè)神經(jīng)氨酸酸酶亞型（NA），理論上可以組合成144種A型流感病毒。A型流感病毒的自然宿主是水禽和家禽。所有亞型都可以感染水禽。A型流感病毒中的三種HA亞型（H1，H2，H3）和兩種NA亞型（N1，N2）上世紀(jì)已經(jīng)廣泛引起人感染，這些在人群間常規(guī)流行的流感稱之為季節(jié)性流感。在美國(guó)，季節(jié)性流感每年可造成2～3萬(wàn)人死亡。HA決定了A型流感病毒的抗原性，新抗原性流感病毒的出現(xiàn)會(huì)導(dǎo)致流感大流行的發(fā)生。例如1918 H1N1亞型“西班牙流感”導(dǎo)致了全世界2000～5000萬(wàn)人死亡，2009年的A/H1N1流感在不到3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)形成全球大流行。禽流感病毒中的H5，H7和H9亞型已經(jīng)從禽類跨種傳播到包括豬、馬和人在內(nèi)的多種哺乳動(dòng)物中。過(guò)去的研究中禽流感感染人或人流感感染鴨都表明其具有種間特異性，流感病毒不能很好復(fù)制。盡管如此，越來(lái)越多的自然感染事件表明流感病毒能夠跨越種間屏障。例如，馬流感H3N8能夠傳染狗，禽流感可以傳染豬和人。2003以來(lái)，高致病性H5N1禽流感以造成546人感染，330人死亡，并且這些感染病例中大多是從感染的禽類直接傳染給人的。A型流感的復(fù)雜性和不斷大流行促使人們要不斷的對(duì)流感的傳播機(jī)制、致病機(jī)制和防治開(kāi)展深入的研究。

3.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒在哺乳動(dòng)物間水平傳播機(jī)制研究中的應(yīng)用

雪貂和豚鼠被廣泛用于A型流感病毒在哺乳動(dòng)物間水平傳播機(jī)制研究。1930年，人們首次將雪貂用于流感病毒分離。自然狀態(tài)下，雪貂對(duì)流感病毒十分敏感并且呈現(xiàn)與人相似的臨床癥狀（如噴嚏，流鼻涕，體溫升高等）。研究表明雪貂的上呼吸道受體與人相似，因此雪貂適用于評(píng)價(jià)A型流感病毒在哺乳動(dòng)物間的傳播能力。在1941年，研究人員首次用雪貂模型研究流感病毒的傳播，發(fā)現(xiàn)感染的雪貂可以進(jìn)一步感染同群健康雪貂，甚至當(dāng)用物理屏障阻隔飛沫后還可以發(fā)生傳播。后來(lái)很多學(xué)者都選擇雪貂作為研究流感病毒傳播的哺乳動(dòng)物模型。但由于雪貂對(duì)多種病原敏感、價(jià)格較貴并且飼養(yǎng)條件要求高，一定程度上限制了流感病毒傳播機(jī)制的研究。人們把目光轉(zhuǎn)向了小鼠，盡管品系較純的小鼠已經(jīng)廣泛用于流感病毒致病力的研究，但僅L.SCHULMAN等證明感染流感的小鼠可以傳染同群的健康小鼠［1］。隨后多位研究者證明絕大多數(shù)流感病毒都不能在小鼠中傳播，甚至1918 H1N1也未能引起傳播。因此，小鼠不適宜作為研究流感傳播的模型。研究人員發(fā)現(xiàn)豚鼠像雪貂一樣對(duì)人流感病毒和禽流感病毒都敏感，他還進(jìn)一步研究證明豚鼠適合研究流感病毒的傳播。人流感病毒在豚鼠中可以高效傳播（包括接觸性傳播和非接觸性傳播）。體積較小、價(jià)格低廉的豚鼠成為研究流感病毒傳播又一個(gè)重要的哺乳動(dòng)物模型，但和雪貂不同，感染的豚鼠臨床癥狀并不明顯，即不易通過(guò)病理改變區(qū)分接觸的豚鼠感染與否。

為探討H5N1亞型流感病毒在哺乳動(dòng)物間水平傳播的能力和分子機(jī)制，我們應(yīng)用豚鼠作為哺乳動(dòng)物模型，評(píng)價(jià)了5株H5N1亞型鴨源和1株候鳥源病毒的復(fù)制和水平傳播能力。結(jié)果其中兩株病毒A/duck/GX/35/01（DKGX/35）和A/Bar-Head Goose/03/2005能夠在豚鼠間水平傳播。應(yīng)用一系列的拯救突變病毒進(jìn)行傳播實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)PB2基因701Asn（N）是DKGX/35水平傳播的一個(gè)必要條件。另一個(gè)決定DKGX/35傳播能力的條件是病毒的受體結(jié)合特性。DKGX/35同時(shí)識(shí)別SAα2，3Gal、SAα2，6Gal和長(zhǎng)型（傘型拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)）SAα2，6Gal受體。血凝素（HA）Q226L和G226S的雙突變可使病毒只具有SAα2，6Gal受體結(jié)合特性，且此突變病毒可在豚鼠間水平傳播。HA的160位氨基酸由Ala（A）變成Thr（T）時(shí)，35/HA-A160T完全轉(zhuǎn)變?yōu)镾Aα 2，3Gal受體結(jié)合特性，該變化導(dǎo)致病毒不能在豚鼠間水平傳播。A160T變異可導(dǎo)致HA增加一個(gè)糖基化位點(diǎn)，從而影響了病毒受體結(jié)合特性。該研究表明H5N1亞型流感病毒的PB2基因與HA基因是決定病毒能否在哺乳動(dòng)物間傳播的關(guān)鍵基因［2］。

家禽（雞、鵪鶉）和豬是流感病毒的中間宿主，流感在這些動(dòng)物體內(nèi)病毒重組和宿主適應(yīng)可能會(huì)發(fā)生，利用這些動(dòng)物作為動(dòng)物模型可以更好的理解宿主適應(yīng)和流感病毒傳播給人類的分子機(jī)制。近來(lái)，貓和狗已被用作流感病毒感染的模型。貓暴露于家禽或者野鳥間自然感染H5N1流感病毒的病例已有報(bào)告，并且H5N1流感病毒可以在貓之間傳播。我們?cè)贖5N1病毒感染虎的研究中發(fā)現(xiàn)尚在哺乳期的小虎也可發(fā)生感染，說(shuō)明H5N1病毒可能氣源途徑傳播。在2004年佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)馬的H3N8流感病毒在狗群間傳播，在韓國(guó)也有發(fā)生狗自然感染H3N2流感病毒的病例。人類經(jīng)常與貓和狗在一起使得研究這些動(dòng)物對(duì)流感病毒的傳播性受到人們的關(guān)注。

3.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒重配研究中的應(yīng)用

近年來(lái)關(guān)于流感病毒重配的研究與報(bào)道正逐步成為熱點(diǎn)，重配流感病毒對(duì)人類構(gòu)成很大的威脅。歷史性的1957年和1968年的大流行的流感病毒被認(rèn)為是禽流感和人類流感病毒的重配病毒，目前2009年的甲流大流行被認(rèn)為是禽流感、豬和人類病毒的重配病毒。流感病毒經(jīng)常在各種生物環(huán)境下循環(huán)，然后進(jìn)入不同的動(dòng)物體內(nèi)，衍生出各類流感病毒。應(yīng)該警惕甲流和禽流感發(fā)生重配變異，若這種現(xiàn)象發(fā)生，對(duì)人類的影響將是災(zāi)難性的。研究人員已通過(guò)應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)重組的方式或應(yīng)用反向遺傳操作技術(shù)人為重配的方式對(duì)A型流感病毒的重配機(jī)制開(kāi)展了一系列的研究。Sara Jackson等人將高致病性低傳播性的禽H5N1、低致病性高傳播性的人H3N2在雪貂體內(nèi)重配，分離純化出5株含有H5N1HA基因的重配病毒［3］。這些結(jié)果說(shuō)明重配病毒能夠在體內(nèi)發(fā)生，這兩種亞型的流感病毒的重配更易發(fā)生在雪貂的上呼吸道。這也很容易的推斷出人季節(jié)性流感病毒與禽H5N1流感病毒持續(xù)暴露，能增加H5亞型重配病毒的可能性及風(fēng)險(xiǎn)。所以在高致病性高傳播性的重配病毒出現(xiàn)之前這些研究就很有必要的，檢測(cè)仍然是公共安全衛(wèi)生的重要措施，以盡量減少這種重配的大流行毒株出現(xiàn)的風(fēng)險(xiǎn)。Chen LM和Chengjun Li等人分別利用反向遺傳操作研究禽H5N1、人H3N2進(jìn)行體外重配病毒，重組病毒的表面基因HA、NA來(lái)自禽H5N1，其余六條片段隨機(jī)組合。近一半的重配病毒在體外顯示高效率復(fù)制，揭示了禽流感病毒和人流感病毒各基因之間的高度兼容性。研究結(jié)果突出監(jiān)測(cè)的重要性，尤其是監(jiān)測(cè)含有人流感病毒PB2段的H5病毒的重配病毒。Sun Y等人利用反向遺傳的方法將禽H9N2和甲流H1N1體外重配，其中重配病毒的PA基因來(lái)自甲流H1N1。結(jié)果顯示這些重配病毒有著很高的兼容性且一半以上的重配病毒在體外能高滴度復(fù)制。所有的結(jié)果提示我們H9亞型的重配流感病毒尤其是含有H1N1/2009起源的PA基因重配病毒的出現(xiàn)對(duì)人類有更高的潛在威脅，H1N1 PA基因的重配病毒具有很高的公共安全衛(wèi)生風(fēng)險(xiǎn)。J.Brian Kimble等人利用反向遺傳的方法將禽H9N2與甲流H1N1進(jìn)行體外重配，并評(píng)估了4株重組病毒在雪貂模型中傳播特性，結(jié)果證明禽流感病毒H9N2的表面基因與H1N1病毒的內(nèi)部基因能通過(guò)飛沫在雪貂間有效地傳播。重配病毒在H1N1病毒的背景下包含H9N2的HA基因或者也包含H9N2的NA基因，產(chǎn)生的4株病毒有3株能有效的進(jìn)行飛沫傳播。但4株病毒存在復(fù)制效率上的差異。結(jié)果清楚地表明，禽流感病毒H9N2和H1N1病毒都可以偶爾感染豬，他們有產(chǎn)生感染哺乳動(dòng)物的的新型重組病毒的潛力。Ca’ssio Pontes Octaviani等人在細(xì)胞MDCK-M2內(nèi)共感染豬H1N1、禽H5N1病毒，并發(fā)現(xiàn)這兩種病毒有很高的遺傳兼容性，有些重配病毒比母本病毒有更好的生長(zhǎng)動(dòng)力［4］。從而推出這兩株病毒之間的重組可以發(fā)生，可能會(huì)造成H5N1重配病毒的大流行。應(yīng)用適宜的動(dòng)物模型評(píng)價(jià)流感病毒株之間的重配機(jī)制及重配病毒的生物學(xué)特性對(duì)流感大流行的預(yù)警和預(yù)測(cè)具有重要作用。

3.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒致病與救治研究中的應(yīng)用

3.1.3.1 小鼠

在流感病毒致病性研究中，小鼠是最常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。季節(jié)性流感病毒一般都不能有效的在小鼠體內(nèi)復(fù)制，病毒在小鼠體內(nèi)連續(xù)傳代后可表現(xiàn)出復(fù)制能力和致病性增強(qiáng)。Puerto Rico/8/34，WSN/33和FM/1/47等季節(jié)性流感病毒在小鼠體內(nèi)適應(yīng)后會(huì)表現(xiàn)出對(duì)小鼠的高致病性，這些毒株稱之為鼠肺適應(yīng)株。HA（G218E）和NS1（D125G）氨基酸的突變與病毒的致病性增強(qiáng)相關(guān)。2009年出現(xiàn)的新型甲型H1N1流感病毒不需要適應(yīng)就可感染小鼠，但同樣表現(xiàn)出較低的致病性。我們?cè)谘芯恐邪l(fā)現(xiàn)A/Jilin/XD/2009在小鼠體內(nèi)經(jīng)18代的適應(yīng)性傳代后，病毒的致病性和抗原性均發(fā)生改變，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)PB2、PB1、PA、HA和NP上氨基酸發(fā)生了變異。高致病性禽流感病毒和1918年西班牙流感病毒無(wú)需經(jīng)過(guò)傳代適應(yīng)就能夠在小鼠上引起嚴(yán)重的疾病。它們可以在小鼠肺部以外的組織中進(jìn)行復(fù)制，并引起高死亡率。高致病性流感病毒聚合酶基因上的突變，例如PB2-E627K突變和PB1-F2蛋白的N66S突變，這些突變已經(jīng)被證明參與損傷適應(yīng)性免疫應(yīng)答和介導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡，這些突變有助于增強(qiáng)病毒的復(fù)制和多器官感染。人感染高致病性禽流感病毒和1918西班牙流感病毒后表現(xiàn)出嚴(yán)重的肺部病理變化，包括肺水腫和大量炎性浸潤(rùn)。比起感染低致病性流感病毒，感染這些病毒可以導(dǎo)致肺部的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞的數(shù)量顯著增加，表明這些細(xì)胞在急性肺損傷扮演重要的角色。一些H5N1亞型高致病性禽流感病毒對(duì)小鼠是致死的，然而其它的則不是。小鼠感染無(wú)致死力的H5N1亞型流感病毒后只會(huì)出現(xiàn)短暫的淋巴細(xì)胞減少，然而當(dāng)小鼠感染H5N1亞型高致病性禽流感病毒后則表現(xiàn)出嚴(yán)重的淋巴細(xì)胞減少癥。小鼠感染致死性的H5N1亞型流感病毒后，肺臟和淋巴樣組織中的CD4+和CD8+T細(xì)胞以及白細(xì)胞介素1β、干擾素γ和趨化因子巨噬細(xì)胞炎性蛋白質(zhì)的合成均減少。相反，感染小鼠腦中的趨化因子和細(xì)胞因子的水平上升，另外有證據(jù)表明感染小鼠的脾臟和肺臟中出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，這些研究結(jié)果表明一個(gè)淋巴細(xì)胞破壞機(jī)制［5］。H5N1亞型流感病毒對(duì)免疫系統(tǒng)的破壞效果也許有助于提高該病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的毒力。

3.1.3.2 雪貂

季節(jié)性人類流感病毒通常對(duì)雪貂有輕度或中度的致病性［6］。雪貂感染的臨床癥狀與人很相似，包括嗜睡，流鼻涕，打噴嚏，發(fā)燒，體重減輕。這些臨床癥狀的嚴(yán)重程度取決于流感病毒的毒株。流感毒株造成雪貂輕微的疾病與肺部輕度炎癥改變相關(guān)。雪貂感染高致病性病毒如H5N1亞型禽流感病毒和1918“西班牙流感”病毒表現(xiàn)出嚴(yán)重的癥狀，有可能引起致死。H5N1病毒能夠在雪貂的腦、脾、腸復(fù)制，而1918年流感病毒已經(jīng)從雪貂的心臟和脾臟分離到。一些數(shù)據(jù)表明H5N1病毒在雪貂和小鼠體內(nèi)具有嗜神經(jīng)性。

3.1.3.3 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物

一般非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物對(duì)流感病毒的易感性比人類要弱，可檢測(cè)到病毒的復(fù)制但動(dòng)物不發(fā)病。一般來(lái)說(shuō)，高劑量的病毒通過(guò)多種途徑注射來(lái)保證動(dòng)物感染流感病毒。比如，恒河猴和短尾猴只有通過(guò)氣管感染和鼻內(nèi)感染H1N1流感病毒時(shí)表現(xiàn)臨床癥狀。短尾猴通過(guò)氣管感染H3N2流感病毒不表現(xiàn)臨床癥狀，盡管可以從鼻拭子和肺灌洗液中分離出病毒。相反，短尾猴感染季節(jié)性H1N1病毒產(chǎn)生疾病的臨床癥狀，包括體重減輕、流涕、發(fā)熱以及與人類相似的肺臟的病理變化。疾病在非人靈長(zhǎng)類也可以進(jìn)展表現(xiàn)出特殊的疾病癥狀，比如感染低毒力病毒后表現(xiàn)出的結(jié)膜炎和鼻液溢。其它流感病毒株，比如高致病力禽流感、1918年流感和2009年H1N1流感病毒在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物體內(nèi)復(fù)制并引起輕度到重度的疾病。1919年流感病毒對(duì)短尾猴具有強(qiáng)致病性，可以引起急性呼吸窘迫并致死。1918年流感病毒呈現(xiàn)復(fù)制能力和組織嗜性不同于同期的人流感。對(duì)于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可以在感染后持續(xù)8天在上呼吸道和下呼吸道檢測(cè)到1918年流感病毒，而季節(jié)性流感病毒僅限制于上呼吸道，一般在感染后6天就被清除。短尾猴和恒河猴同時(shí)也被用于研究高致病性H5N1流感病毒發(fā)病機(jī)制的動(dòng)物模型。這些猴子表現(xiàn)出與人類相似的系統(tǒng)性癥狀，包括發(fā)熱、疲倦、食欲下降，但呼吸系統(tǒng)相關(guān)癥狀不明顯［7，8］。

3.1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒靶向藥物研究中的應(yīng)用

在流感的救治研究中，最常用的動(dòng)物模型同樣是小鼠。我們以小鼠為模型，開(kāi)展了靶向藥物的研究。我們以禽流感病毒單鏈抗體作為靶向部分，以特異性抗禽流感病毒的反義核酸為殺傷感染細(xì)胞的效用部分，開(kāi)展了靶向抗流感病毒藥物研究。小鼠體內(nèi)的攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示針對(duì)PA基因的PA492和針對(duì)NP基因的NP628反義核酸均能保護(hù)部分小鼠免受致死劑量H5N1禽流感病毒的攻擊，保護(hù)率分別為50％和37.5％；同時(shí)PA492也能有效地保護(hù)小鼠免受致死劑量甲型H1N1流感病毒的攻擊，保護(hù)率達(dá)80％；進(jìn)一步不同時(shí)間感染小鼠的體內(nèi)肺病毒滴度和肺感染指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果也顯示PA492和NP628能抑制H5N1或H1N1流感病毒在小鼠體內(nèi)的復(fù)制。禽流感病毒的血凝素抗原（HA）在感染細(xì)胞表面大量存在，能夠在抗病毒靶向性治療中作為特異性抗體的靶標(biāo)。我們將禽流感病毒HA特異性的scFv基因和截短的人魚精蛋白基因通過(guò)連接子（linker）結(jié)合，將獲得的融合蛋白進(jìn)行原核表達(dá)、純化和復(fù)性，能夠從1L細(xì)菌培養(yǎng)物中獲得約6mg、純度約為90％的融合蛋白，復(fù)性率約為5％。細(xì)胞ELISA和間接免疫熒光試驗(yàn)顯示融合蛋白對(duì)HA具有和單獨(dú)單鏈抗體相似的識(shí)別和結(jié)合活性，以劑量依賴性方式和HA結(jié)合。EMSA試驗(yàn)顯示融合蛋白能夠有效結(jié)合DNA。流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示融合蛋白能介導(dǎo)含EGFP質(zhì)粒和FITC標(biāo)記的寡核苷酸特異性的傳遞到病毒感染的細(xì)胞表面。在融合蛋白結(jié)合反義核酸的實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)病毒滴度、熒光定量PCR和間接免疫熒光試驗(yàn)顯示融合蛋白能夠提高PA492在MDCK細(xì)胞上的抗病毒活性，體內(nèi)傳遞試驗(yàn)顯示融合蛋白能夠介導(dǎo)FITC標(biāo)記的PA492進(jìn)入禽流感病毒感染的小鼠肺部組織，小鼠體內(nèi)的攻毒保護(hù)試驗(yàn)顯示融合蛋白介導(dǎo)的PA492能夠部分保護(hù)小鼠免受致死劑量H5N1流感病毒的攻擊，保護(hù)率達(dá)62.5％，效果稍好于脂質(zhì)體的介導(dǎo)（50％存活率）。此外，融合蛋白介導(dǎo)的PA492和脂質(zhì)體介導(dǎo)的藥物相比在感染小鼠體內(nèi)有更低的肺感染指數(shù)和肺病毒滴度［9，10］。

3.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在狂犬病防控研究中的應(yīng)用

狂犬病（Rabies）俗稱瘋狗病，又名恐水癥，是一種侵害中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性人獸共患傳染病，所有溫血?jiǎng)游锇ㄈ祟悾鼙桓腥?。野生?dòng)物是該病的主要貯存宿主，不同動(dòng)物對(duì)狂犬病的敏感性差異大，其中患狂犬病的犬是人感染狂犬病的主要傳染源。用于狂犬病研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物主要包括：小鼠、家兔、豚鼠及非人靈長(zhǎng)類（恒河猴）等，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物廣泛應(yīng)用于狂犬病病原學(xué)、發(fā)病機(jī)制、疫苗及免疫學(xué)等各個(gè)研究領(lǐng)域。

3.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在狂犬病病原診斷學(xué)研究中的應(yīng)用

通過(guò)接種動(dòng)物或細(xì)胞分離培養(yǎng)病毒是最常用的病毒確診方法。病毒分離后才能對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步傳代，并通過(guò)抗原或遺傳進(jìn)化分析進(jìn)行特性鑒定。乳鼠腦內(nèi)接種試驗(yàn)是目前最常用的狂犬病病毒（Rabies virus，RABV）分離方法，該方法敏感、可靠。本課題組近幾年來(lái)通過(guò)乳鼠腦內(nèi)接種試驗(yàn)已經(jīng)分離到15株狂犬病病毒街毒株，并對(duì)其全基因組核苷酸序列進(jìn)行了測(cè)定分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)我國(guó)的流行性街毒株均為基因I型，形成2個(gè)進(jìn)化群，進(jìn)化I群與中國(guó)犬源街毒株BD06進(jìn)化關(guān)系極其相近，II群與人源街毒株HN10同在一個(gè)進(jìn)化分支。小鼠腦內(nèi)中和試驗(yàn)是最早被采用的狂犬病病毒抗體檢測(cè)方法，以小鼠或乳鼠測(cè)定病毒-血清感作后殘存的病毒感染力。但由于此法操作繁瑣，目前已基本被細(xì)胞水平的中和試驗(yàn)所代替。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在狂犬病致病機(jī)制研究中的應(yīng)用

目前對(duì)于狂犬病的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，狂犬病實(shí)驗(yàn)動(dòng)物人工感染模型的建立對(duì)于認(rèn)識(shí)狂犬病的自然發(fā)病機(jī)制具有重要借鑒意義?？袢〔《揪哂袊?yán)格的嗜神經(jīng)性，病毒自咬傷部位入侵后，通過(guò)神經(jīng)-肌肉接頭或神經(jīng)傳感器侵入外周神經(jīng)，再延脊髓到達(dá)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS），病毒在CNS進(jìn)行大量增殖后離心傳播至外周神經(jīng)系統(tǒng)。人或動(dòng)物自然感染狂犬病通常具有較長(zhǎng)的潛伏期，且時(shí)間長(zhǎng)短不一。目前尚不完全明確狂犬病病毒自感染部位進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前是否在局部進(jìn)行增殖，Murphy等以病毒感染新生地鼠的實(shí)驗(yàn)研究表明：病毒可在接種部位的橫紋肌內(nèi)增殖［11］。因此病毒感染和增殖的局部可能是狂犬病病毒長(zhǎng)時(shí)間隱蔽的場(chǎng)所，F(xiàn)ekadu及Chaltron分別以犬和臭鼬證明了此實(shí)驗(yàn)結(jié)果。與上述結(jié)果不同，Shandkar以病毒人工感染小鼠咬肌后發(fā)現(xiàn)：病毒進(jìn)入肌肉組織后不在局部復(fù)制而是直接侵犯中樞神經(jīng)系統(tǒng)。狂犬病病毒一旦進(jìn)入外周傳入神經(jīng)纖維之后，便在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)向心性運(yùn)行。分別以狂犬病病毒固定毒株及街毒株感染小鼠模型的試驗(yàn)表明：固定毒株向心性運(yùn)行速度為3.0mm/h，而街毒株的運(yùn)行速度要比固定毒株慢的多。Dean等將相同劑量的狂犬病病毒Flury LEP分別接種狐貍頸部和腿部肌肉，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與腿部肌肉注射相比，頸部注射試驗(yàn)動(dòng)物潛伏期短、發(fā)病快及死亡率高?？袢〔《驹谀X內(nèi)大量增殖后，一方面引起神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，一方面通過(guò)在傳出性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)、感覺(jué)神經(jīng)和自主神經(jīng)系統(tǒng)中運(yùn)行到達(dá)所支配的組織和器官，導(dǎo)致非神經(jīng)組織的感染?？袢〔《倦S著腺體細(xì)胞的分泌進(jìn)入唾液內(nèi)，進(jìn)而通過(guò)唾液傳播至其它動(dòng)物或人。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物感染試驗(yàn)表明：感染動(dòng)物唾液腺的感染性高低與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種類密切相關(guān)，如犬、貓的感染性高（74％～88％），而奶牛的感染性則較低（47％）。

研究表明：乙酰膽堿受體（AchR）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（NCAM）及神經(jīng)生長(zhǎng)因子受體（p75NTR）可能是介導(dǎo)狂犬病病毒感染機(jī)體的受體。但NCAM及p75NTR基因缺失小鼠仍可感染狂犬病病毒的試驗(yàn)表明：狂犬病病毒的真正受體有待進(jìn)一步研究［12，13］。

3.2.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在狂犬病疫苗研究中的應(yīng)用

預(yù)防與控制狂犬病有兩大手段：一是動(dòng)物的免疫。眾所周知，患病動(dòng)物是人狂犬病的傳染源，有效地預(yù)防動(dòng)物狂犬病的流行，是控制人狂犬病發(fā)生的根本。日本、美國(guó)和西歐等多數(shù)發(fā)達(dá)國(guó)家通過(guò)預(yù)防和控制動(dòng)物的狂犬病，已經(jīng)基本甚至完全消除了人的狂犬病。其二是人的免疫與治療。人的免疫分為暴露前和暴露后免疫，暴露前免疫是給經(jīng)常與狂犬病病毒或動(dòng)物接觸的人接種疫苗，暴露后免疫是給被患狂犬病動(dòng)物或者疑似狂犬病動(dòng)物咬、舔、抓傷的人及時(shí)接種疫苗及抗狂犬病免疫球蛋白。因此，安全、高效的狂犬病疫苗是控制狂犬病的基礎(chǔ)。目前，人用狂犬病疫苗主要為滅活、純化的細(xì)胞培養(yǎng)疫苗，該疫苗具有安全、高效等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于人狂犬病的暴露前及暴露后預(yù)防免疫。在疫苗制備過(guò)程中的安全性檢測(cè)、效價(jià)評(píng)價(jià)（NIH效力測(cè)定）等均以小鼠為動(dòng)物模型進(jìn)行。當(dāng)前狂犬病疫苗的研發(fā)主要集中于流浪犬、貓及野生動(dòng)物用口服疫苗。Kiney等構(gòu)建了痘苗-狂犬病病毒糖蛋白（VRG）重組病毒，該疫苗可在小鼠模型誘導(dǎo)產(chǎn)生高水平的狂犬病病毒中和抗體，并能抵抗致死性強(qiáng)毒攻擊。目前該疫苗已在美國(guó)取得生產(chǎn)許可并廣泛用于野生動(dòng)物的免疫。Schnell等利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)2個(gè)糖蛋白及3個(gè)糖蛋白的重組狂犬疫苗，傅振芳等構(gòu)建了表達(dá)先天性免疫刺激因子的重組病毒［14］，在小鼠動(dòng)物模型中，此類疫苗不僅對(duì)狂犬病具有良好的暴露前免疫預(yù)防效果，且具有顯著的暴露后治療效果。本實(shí)驗(yàn)室近年來(lái)也建立了狂犬病病毒ERA、CVS-11、SRV9株的反向遺傳操作系統(tǒng)，并以此為基礎(chǔ)構(gòu)建了G蛋白突變株狂犬病病毒（rRVG*），該病毒對(duì)乳鼠的致病力明顯降低，對(duì)成年鼠無(wú)致病性，同時(shí)可在犬體內(nèi)誘導(dǎo)良好的免疫反應(yīng)。

3.2.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在狂犬病免疫研究中的應(yīng)用

3.2.4.1 保護(hù)性免疫應(yīng)答

狂犬病病毒固定毒株感染刺激機(jī)體產(chǎn)生的抗病毒免疫應(yīng)答可有效阻止狂犬病的發(fā)生，說(shuō)明狂犬病病毒街毒株的致病性取決于病毒在CNS中傳遞卻不引起保護(hù)性免疫應(yīng)答的能力。Kaplan及Hooper等以不同病毒毒株感染小鼠后發(fā)現(xiàn)，病毒的免疫原性與其糖蛋白的表達(dá)成正相關(guān)，因此病毒自身結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)量可顯著影響抗病毒免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)。Morimoto等分別以表達(dá)低水平糖蛋白的高致病性病毒株CVS-N2c及表達(dá)高水平糖蛋白的低致病性病毒株CVS-B2c感染正常小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CVS-N2c感染過(guò)程中由于糖蛋白表達(dá)水平低，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡能力也降低，免疫原性弱，因此高致病性狂犬病病毒株感染過(guò)程中T細(xì)胞功能及中和抗體水平均降低。與高致病性狂犬病病毒相比，低致病性病毒感染小鼠后可在腦內(nèi)誘導(dǎo)高水平的MHC-2分子表達(dá)。此外，狂犬病病毒感染可下調(diào)細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能。Camelo等以TNF-α p55受體基因缺失小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)，與正常小鼠相比，TNF-α p55受體基因缺失小鼠感染高神經(jīng)嗜性的狂犬病病毒CVS11后出現(xiàn)低水平的免疫抑制，因此TNF-α p55受體依賴通路可能參與此機(jī)制［15］。

病毒入侵機(jī)體后，會(huì)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生一系列的免疫應(yīng)答過(guò)程，包括先天性免疫和獲得性免疫反應(yīng)?？袢”┞逗蟛灰欢馨l(fā)病，可能因?yàn)椴《緵](méi)有成功引起感染，或雖引起感染但卻被機(jī)體產(chǎn)生的免疫反應(yīng)控制在早期階段。Fu等以小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)，狂犬病病毒致弱毒株可激活機(jī)體的先天性免疫應(yīng)答，尤其是IFN-α/β信號(hào)通路［16］?？袢〔《局氯醵局旮腥竞?，若干IFN介導(dǎo)的信號(hào)通路和細(xì)胞轉(zhuǎn)錄活化過(guò)程中所參與的基因均發(fā)生上調(diào)，主要包括干擾素信號(hào)通路基因（Stat 1、2、3和Jak-2）和干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF-1、2、7）。除IFN-α/β通路外，狂犬病病毒致弱毒株可同時(shí)刺激其它先天性免疫分子的表達(dá)，如細(xì)胞因子、趨化因子、TLRs及補(bǔ)體成分等。先天性免疫分子表達(dá)的增多，可進(jìn)一步引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。Zhao等以反向遺傳技術(shù)構(gòu)建了表達(dá)MIP-1α、RANTES及IP-10等先天性免疫分子的重組狂犬病病毒，以小鼠為動(dòng)物模型研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)MIP-1α的重組病毒通過(guò)誘導(dǎo)短暫的先天性免疫應(yīng)答而進(jìn)一步降低病毒的致病性。然而表達(dá)RANTES及IP-10的重組病毒因持續(xù)誘導(dǎo)高水平的趨化因子表達(dá)，中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及血腦屏障通透性的變化而增強(qiáng)了病毒致病性。此外，先天性免疫分子的表達(dá)還可通過(guò)聚集、激活樹突狀細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞增強(qiáng)病毒的適應(yīng)性免疫應(yīng)答。Wen等將構(gòu)建的表達(dá)MIP-1α及樹突狀細(xì)胞刺激分子的重組病毒通過(guò)肌肉注射免疫小鼠，與母本病毒相比，重組病毒可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生更高水平的狂犬病病毒中和抗體，并保護(hù)更多的小鼠免受強(qiáng)毒攻擊。Wang等以小鼠為動(dòng)物模型，研究表達(dá)粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）的重組病毒在狂犬病暴露后治療中的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：即使在暴露后第5天，重組病毒仍然具有良好的暴露后治療作用，此新型疫苗不僅可用于狂犬病的暴露前及暴露后預(yù)防，還可能用于狂犬病的臨床治療。其保護(hù)機(jī)制可能為：重組病毒在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中誘導(dǎo)的先天性免疫分子表達(dá)及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)不僅可清除病毒感染細(xì)胞，將感染控制在早期階段，還可增強(qiáng)血腦屏障通透性，進(jìn)而使外周產(chǎn)生的抗體分子或B淋巴細(xì)胞得以進(jìn)入中樞神經(jīng)系統(tǒng)而進(jìn)一步清除病毒感染細(xì)胞。Hooper等以RABV致弱毒株感染小鼠后發(fā)現(xiàn)，可從CNS清除病毒的正常小鼠CNS內(nèi)存在B淋巴細(xì)胞（CD19）和λ輕鏈mRNAs，并可檢測(cè)到狂犬病病毒中和抗體，從CNS分離的B細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后也能產(chǎn)生RABV特異性抗體。因此，CNS中的特異性抗體可能是由滲入的B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，而不是外周循環(huán)抗體滲入。

病毒感染或自身免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的CNS炎癥反應(yīng)中，血腦屏障完整性的喪失通常可引起嚴(yán)重的神經(jīng)癥狀。Hooper等發(fā)現(xiàn)狂犬病病毒致弱毒株CVSF3在小鼠腦內(nèi)的清除是個(gè)例外，病毒清除過(guò)程中伴隨血腦屏障通透性的增加及CNS炎癥反應(yīng)，而沒(méi)有出現(xiàn)神經(jīng)病理學(xué)變化。通常認(rèn)為TNF-α與血腦屏障通透性的增加密切相關(guān)，Phares等以TNF-α（TNF-/-）、B細(xì)胞（JHD-/-）、T細(xì)胞及B細(xì)胞（RAG-2-/-）基因缺失小鼠為模型研究發(fā)現(xiàn)：狂犬病病毒感染中CNS內(nèi)TNF-α的表達(dá)與血腦屏障通透性的變化無(wú)關(guān)，CD4+T細(xì)胞而不是CD8+T細(xì)胞或B細(xì)胞為增強(qiáng)血腦屏障通透性所必需。Roy等分別以實(shí)驗(yàn)室致弱毒株和街毒株感染小鼠后發(fā)現(xiàn)，街毒株也在外周刺激機(jī)體產(chǎn)生高水平的免疫應(yīng)答，而CNS內(nèi)浸潤(rùn)的免疫炎性細(xì)胞卻很少。因此，街毒株感染的高致死率與不能增強(qiáng)血腦屏障的通透性及不能輸送病毒特異性免疫效應(yīng)因子進(jìn)入CNS有關(guān)［17］。PLSJL小鼠具有較低的下丘腦-垂體-腎上腺軸活性，卻可介導(dǎo)高水平的CNS炎性反應(yīng)。Roy等以狂犬病病毒SHBRV株分別感染PLSJL及129/SvEv小鼠，50％的PLSJL小鼠可抵御SHBRV感染，而所有的129/SvEv小鼠均死于狂犬病感染。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩類小鼠對(duì)狂犬病病毒感染的敏感性差異主要取決于PLSJL小鼠可增強(qiáng)血腦屏障通透性［18］。因此，設(shè)法使外周產(chǎn)生的免疫效應(yīng)因子通過(guò)血腦屏障進(jìn)入CNS是感染狂犬病病毒后機(jī)體存活或治療所必需的。

細(xì)胞免疫和體液免疫是分別由T、B淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)。以淋巴細(xì)胞基因缺失小鼠為模型研究其對(duì)狂犬病病毒的敏感性發(fā)現(xiàn)，CD8+T細(xì)胞基因敲除小鼠對(duì)病毒不敏感，而T、B細(xì)胞缺失小鼠或B細(xì)胞缺失小鼠對(duì)病毒的敏感性增加。此外，B細(xì)胞缺失但有功能性CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的JHD小鼠，在感染狂犬病病毒致弱毒株后，盡管不能完全清除CNS中的病毒，但其存活時(shí)間明顯延長(zhǎng)。因此，T淋巴細(xì)胞及B淋巴細(xì)胞在控制RABV感染中均具有重要作用。

3.2.4.2 致病性免疫應(yīng)答

免疫不完全的動(dòng)物通常比未免疫動(dòng)物死的更快的“早死現(xiàn)象”同樣支持了免疫應(yīng)答可增加致病性的觀點(diǎn)。Prabhakar及Smith等研究發(fā)現(xiàn)RABV感染后免疫缺陷小鼠比正常小鼠存活時(shí)間長(zhǎng)，表明免疫應(yīng)答可加速RABV感染動(dòng)物死亡。感染RABV的免疫缺陷小鼠注射免疫血清或過(guò)繼免疫狂犬病康復(fù)動(dòng)物淋巴細(xì)胞后，同樣可加速其發(fā)病與死亡，說(shuō)明抗病毒免疫血清同樣可增強(qiáng)病毒致病性?？袢〔《救肭帧?fù)制及在CNS傳播與激活抗病毒免疫應(yīng)答所需時(shí)間之間的短暫平衡共同決定了免疫介導(dǎo)的CNS組織損傷。因此不難理解RABV感染的人或動(dòng)物存活后留有嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，這主要是由病毒從CNS的清除所致。

Prosniak研究發(fā)現(xiàn)RABV感染小鼠腦內(nèi)一些利于病毒復(fù)制的生長(zhǎng)因子及細(xì)胞功能均上調(diào)，可能是免疫效應(yīng)因子誘導(dǎo)了這些分子的表達(dá)。此外，不同的RABV均可在體外多種細(xì)胞內(nèi)增殖［20］。這些數(shù)據(jù)均表明，先天性或適應(yīng)性免疫應(yīng)答可能直接或間接提高病毒的復(fù)制與傳播。Roy發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞也可感染RABV，因此這些細(xì)胞可能將病毒從低神經(jīng)支配區(qū)域傳遞至高神經(jīng)支配區(qū)域，進(jìn)而加速病毒進(jìn)入CNS，這或許能解釋近年來(lái)發(fā)生的RABV可通過(guò)器官移植進(jìn)行傳播。

盡管保護(hù)性免疫應(yīng)答對(duì)清除狂犬病病毒感染有重要作用，及時(shí)并適當(dāng)?shù)拿庖邞?yīng)答可阻止致死性結(jié)果，但免疫應(yīng)答通常也會(huì)增強(qiáng)病毒的致病性，功能性的免疫病理通常與病毒的清除密切相關(guān)。在感染到達(dá)CNS的重要區(qū)域時(shí)，保護(hù)性免疫應(yīng)答可加速動(dòng)物的死亡。因此，感染途徑、RABV傳播至CNS的能力、在不引發(fā)保護(hù)性免疫反應(yīng)情況下病毒進(jìn)行復(fù)制的特性、免疫應(yīng)答產(chǎn)生的時(shí)間、免疫反應(yīng)的本質(zhì)共同決定了暴露后的結(jié)果。

狂犬病是一種烈性的接觸性傳染病，是危害人類和家畜的主要疾病之一。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型特別是嚙齒動(dòng)物模型的建立，已在狂犬病的致病機(jī)制及治療措施中得到了廣泛應(yīng)用，對(duì)預(yù)防、控制和治療狂犬病的發(fā)生有重大意義，但嚙齒類動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?duì)研究自然感染還存在極大的局限性。此外還有一個(gè)問(wèn)題值得關(guān)注，研究使用的病毒粒子數(shù)比唾液中傳播的病毒粒子數(shù)要多，但這是保證成功建立病毒感染模型所需。以后的工作旨在建立更完善的模型用于更好的再現(xiàn)自然感染現(xiàn)象，更好的應(yīng)用于對(duì)狂犬病的研究。

4 人獸共患病研究中的新動(dòng)物模型研究

4.1 野生動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化研究

我國(guó)擁有豐富的野生動(dòng)物資源優(yōu)勢(shì)，有針對(duì)性的加強(qiáng)和加快野生動(dòng)物的開(kāi)發(fā)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化，對(duì)提升實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源的豐富程度，推動(dòng)我國(guó)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)的發(fā)展，為生命科學(xué)研究提供有力的支撐條件起著重要的作用。

4.1.1 樹鼩

⑨愛(ài)新覺(jué)羅·弘歷:《安瀾園記》，于敏中等編纂:《日下舊聞考》卷八二《國(guó)朝苑囿》，北京古籍出版社2001年版，第1366頁(yè)。

樹鼩屬于哺乳綱攀鼩目，我國(guó)從20世紀(jì)70年代開(kāi)始樹鼩的人工馴養(yǎng)繁殖，目前僅昆明地區(qū)就有近十個(gè)單位從事樹鼩的馴化繁殖和銷售。樹鼩曾用于甲型肝炎病毒、輪狀病毒、單純皰疹病毒、登革病毒的研究。新近的研究表明樹鼩可作為研究乙型、丙型和丁型肝炎的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，而且還有望作為艾滋病病毒研究的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

4.1.2 東方田鼠

東方田鼠可作為血吸蟲抗病模型，該動(dòng)物對(duì)血吸蟲感染具先天抗性。日本血吸蟲尾蚴感染東方田鼠后，盡管蟲體在感染后11d內(nèi)能正常發(fā)育，但從第12天開(kāi)始，蟲體生長(zhǎng)發(fā)育停滯，第20～28天蟲體在體內(nèi)全部消亡。研究人員將東方田鼠體內(nèi)對(duì)日本血吸蟲童蟲有明顯殺滅作用的基因和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)，可提高小鼠抗日本血吸蟲的能力。采用東方田鼠感染血清篩選到數(shù)個(gè)新的血吸蟲抗原基因，提出了新的疫苗候選分子。

4.1.3 布氏田鼠

1994年，布氏田鼠作為實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物被引入實(shí)驗(yàn)室。鼠疫桿菌經(jīng)布氏田鼠適應(yīng)后對(duì)人的致病力減弱，可用于研究宿主感染相關(guān)機(jī)制。SARS-CoV可以有效感染布氏田鼠，成年布氏田鼠比幼年動(dòng)物對(duì)SARS-CoV更敏感。布氏田鼠有望成為一種比較理想的小型SARS動(dòng)物模型。

4.1.4 旱獺

旱獺屬于嚙齒目松鼠科，是一種公認(rèn)的研究人類乙型肝炎（HBV）動(dòng)物模型，可用于感染和致病機(jī)制研究。患有慢性撥鼠肝炎的旱獺是人類HBV慢性感染的抗病毒治療的臨床前評(píng)估最有價(jià)值的動(dòng)物模型。

4.2 生物技術(shù)在新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中的應(yīng)用

隨著生物學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展，特別是基因敲除技術(shù)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型研究中的廣泛應(yīng)用，從而使實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品種、品系及具有特定特征的模型動(dòng)物種類數(shù)量快速增長(zhǎng)。通過(guò)對(duì)這些模型的研究，可為發(fā)病機(jī)制與藥物靶點(diǎn)篩選提供新的思路。

基因敲除又稱基因打靶，通過(guò)外源DNA與染色體DNA之間的同源重組，精細(xì)地定點(diǎn)修飾和改造基因DNA片段。研究人員已應(yīng)用該技術(shù)成功構(gòu)建了心血管疾病、神經(jīng)退化性疾病、糖尿病、癌癥等小鼠模型。2002年，賴良學(xué)等用核移植的方法獲得了敲除了α-1，3-半乳糖苷酶基因的克隆豬，是第一個(gè)將該技術(shù)應(yīng)用于大型哺乳動(dòng)物的成功工作。

轉(zhuǎn)基因技術(shù)是指將具有特殊性狀的外源基因轉(zhuǎn)入動(dòng)物整合表達(dá)，使定向改變動(dòng)物性狀成為可能。轉(zhuǎn)基因技術(shù)在動(dòng)物基因表達(dá)調(diào)控、癌癥動(dòng)物模型、基因治療與腫瘤學(xué)等諸多領(lǐng)域中發(fā)揮著巨大的作用。將小兒麻痹病毒的細(xì)胞性受體基因（human PVR gene）顯微注射至C57BL/10小鼠的早期胚胎中，制作轉(zhuǎn)基因小鼠并育成品系。這種小鼠表達(dá)人源的受體，有小兒麻痹病毒的感受性。而且感染了這種病毒的小鼠表現(xiàn)出和人一樣的臨床癥狀，對(duì)病毒株的特異性也表現(xiàn)出與人相同的性質(zhì)。因此，這種小鼠除了是人的疾病模型之外，同時(shí)還可能替代猴子進(jìn)行小兒麻痹病毒的效果、特異性等的檢定，具有廣泛的用途。此外在傳染病研究中，抗病轉(zhuǎn)基因動(dòng)物也成為了研究熱點(diǎn)。

5 人獸共患病與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康

感染實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的人獸共患病會(huì)造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的死亡和質(zhì)量下降，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗，而且還會(huì)危害人類和其它動(dòng)物的健康。對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物危害嚴(yán)重的人獸共患病包括流行性出血熱、狂犬病、流感、沙門氏菌、布氏桿菌、弓形體、鉤端螺旋體病等。還有一些動(dòng)物傳染病會(huì)嚴(yán)重威脅到實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的健康如：鼠痘、犬瘟熱、貓瘟熱、犬出血性腸炎和兔瘟等。

5.1 流行性出血熱

流行性出血熱（EHF）又稱腎綜合征出血熱（HFRS）是由漢坦病毒引起傳播的一類人獸共患傳染病，黑線姬鼠、田鼠和小家鼠是主要的儲(chǔ)存宿主和傳染源。人、大鼠、小鼠、豚鼠和兔均易感，因此該病對(duì)人和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康均構(gòu)成威脅。目前我國(guó)大陸的31個(gè)省、市、自治區(qū)均有病例發(fā)生，臺(tái)灣也有病例報(bào)告。年發(fā)病數(shù)最高曾超過(guò)11萬(wàn)，近十年來(lái)發(fā)病人數(shù)一直在2～5萬(wàn)左右。國(guó)內(nèi)多次發(fā)生因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物攜帶病原而導(dǎo)致人的感染。如2001年6月，在北京，因使用不合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)不規(guī)范致使流行性出血熱感染研究人員，導(dǎo)致700多師生緊急預(yù)防接種；2002年11月湖北省藥檢學(xué)校的一名學(xué)生接觸了帶出血熱病毒的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物而感染死亡；2006年，東北三省由于個(gè)體戶繁養(yǎng)和長(zhǎng)途販運(yùn)不合格實(shí)驗(yàn)動(dòng)物致使幾十名教學(xué)科研人員感染。

5.2 布魯氏菌病

布魯氏菌?。ê?jiǎn)稱布?。┦怯刹剪斒暇鸬囊环N人獸共患傳染病，該病廣泛分布于世界各地，據(jù)報(bào)道有170多個(gè)國(guó)家和地區(qū)有布病疫情，其中人布病發(fā)病率超過(guò)1/10萬(wàn)的國(guó)家有19個(gè)，每年新發(fā)病人數(shù)超過(guò)50萬(wàn)人。55個(gè)國(guó)家的綿羊、山羊有布病流行，33個(gè)國(guó)家的豬有布病存在。每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)百億美元。近十幾年來(lái)，該病發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趨勢(shì)。該病對(duì)以羊?yàn)閷?shí)驗(yàn)動(dòng)物的研究人員威脅嚴(yán)重。2010年12月19日，東北農(nóng)業(yè)大學(xué)因未按規(guī)定使用羊進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn)導(dǎo)致28名師生感染。犬科動(dòng)物也有感染布魯氏菌的報(bào)道，應(yīng)引相關(guān)人員的重視。

5.3 弓形蟲病

弓形蟲病是一種重要的動(dòng)物源性人獸共患寄生蟲病，弓形蟲和其它頂復(fù)亞門原蟲不同，生活史復(fù)雜，宿主類型多，組織寄生性廣泛，病程長(zhǎng)而隱匿。估計(jì)全世界至少有三分之一的人感染弓形蟲，1985年的調(diào)查發(fā)現(xiàn)美國(guó)感染率為84％、法國(guó)為90％，我國(guó)1986年調(diào)查發(fā)現(xiàn)抗體陽(yáng)性率為5.169％。弓形蟲的終未宿主為貓和貓科動(dòng)物，中間宿主為人、小鼠、家鼠，其它哺乳類，鳥類和爬行類等。

5.4 鼠痘

鼠痘病毒，又名脫腳病，是實(shí)驗(yàn)小鼠最嚴(yán)重的病毒之一，傳播快，死亡率高。小鼠，特別是A系、C3H、DBA/2、BALB/C、CBA等品系小鼠。國(guó)內(nèi)普通實(shí)驗(yàn)鼠抗體陽(yáng)性率為30％～70％。

5.5 犬瘟熱

犬瘟熱是對(duì)犬科動(dòng)物危害最大的一種病毒性傳染病，貓科動(dòng)物及大熊貓等動(dòng)物均可感染。臨床上主要表現(xiàn)為發(fā)熱、膿性鼻炎、肺炎、腸炎和結(jié)膜炎，有時(shí)出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。該病傳染性強(qiáng)，發(fā)病率可達(dá)100％，病死率達(dá)80％。該病對(duì)犬科實(shí)驗(yàn)動(dòng)物威脅較大，更重要的是還發(fā)現(xiàn)該病可跨種傳播感染彌猴。2006年至2009年期間，我國(guó)廣西、湖北、云南等地養(yǎng)猴場(chǎng)、動(dòng)物園和靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心爆發(fā)多起無(wú)明顯季節(jié)性、群體性恒河猴、食蟹猴類似麻疹的感染，其臨床癥狀為高燒、典型上呼吸道感染及卡他癥狀、咽喉紅腫、舌頭乳頭點(diǎn)狀出血、皮疹、腹瀉及嚴(yán)重肺炎，其中幼齡恒河猴易感，發(fā)病率約60％，死亡率高達(dá)30％，成年恒河猴發(fā)病率約25％，死亡率約5％。疫情使得猴場(chǎng)經(jīng)濟(jì)損失嚴(yán)重、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心有關(guān)猴的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)不能進(jìn)行。我們通過(guò)病原分離，序列測(cè)定（GenBank：FJ405224和FJ405225）和犬與雪貂的人工感染實(shí)驗(yàn)證實(shí)此次大規(guī)模猴群發(fā)病為麻疹病毒屬的犬瘟熱病毒強(qiáng)毒株。

6 結(jié)論與展望

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是人獸共患傳染病研究的重要支撐平臺(tái)。有人統(tǒng)計(jì)生物醫(yī)學(xué)的科研課題有百分六十以上需要用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，甚至有許多課題的研究離開(kāi)了實(shí)驗(yàn)動(dòng)物就寸步難行。我國(guó)也已成立了專門的研究中心與管理體系。今后還要進(jìn)一步制定并執(zhí)行相關(guān)管理法規(guī)，保證實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量，符合國(guó)際統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)和規(guī)定。同時(shí)在人獸共患傳染病研究中更廣泛的應(yīng)用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，為保障人類健康服務(wù)。

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