模型動(dòng)物在動(dòng)物流感病毒傳播機(jī)制研究中的應(yīng)用

高玉偉，桑曉宇，3，夏咸柱

(1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所，長(zhǎng)春 130062；2.吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春 130062；3.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所，哈爾濱 150001)

2003以來，A型高致病性 H5N1亞型禽流感病毒直接突破種間障礙，造成546人感染，330人死亡。2009年4月豬源三重組A型H 1N1亞型流感病毒在人間水平傳播，引發(fā)大流行［1］。動(dòng)物流感病毒特別是A型流感病毒的跨種傳播問題引起了人們的高度關(guān)注。A型流感病毒包括16個(gè)血凝素亞型(HA)和9個(gè)神經(jīng)氨酸酶亞型(NA)，理論上可以組合成144種A型流感病毒。依據(jù)宿主來源可將流感分為人流感、禽流感、馬流感和豬流感等。在自然界中，水禽是A型流感病毒的天然儲(chǔ)存庫(kù)，幾乎所有亞型都可以在水禽中分離到。人流感病毒亞型主要有H1N1、H2N2和H3N2。馬流感病毒只有兩個(gè)抗原性不同的亞型：H7N7和H3N8。豬流感病毒至少有七種不同血清亞型(H1N1、H1N2、H1N7、H3N2、H3N6、H4N6和H9N2)，其中占絕大多數(shù)的是古典型豬 H 1N1、類禽型H1N1和類人型H 3N2三種毒株。在過去的研究中發(fā)現(xiàn)禽流感病毒很難感染人，同樣人流感病毒也無法有效感染禽類，這表明不同物種來源的A型流感病毒具有相對(duì)嚴(yán)格的種屬特異性。但近年來發(fā)現(xiàn)，越來越多的自然感染事件表明流感病毒能夠跨越種間屏障。例如，禽流感和豬流感對(duì)人的跨種傳播，馬流感 H3N8對(duì)狗的跨種傳播［2］。A型流感病毒跨種傳播取決于病毒因適應(yīng)性變異導(dǎo)致的宿主范圍變化、宿主自身的限制性因素和環(huán)境因素的變化。

1 A型流感病毒的宿主范圍

A型流感病毒對(duì)宿主的吸附能力、復(fù)制能力以及從宿主細(xì)胞內(nèi)的釋放能力決定了病毒感染宿主的宿主范圍。流感病毒對(duì)宿主的吸附能力主要取決于其血凝素蛋白(HA)對(duì)宿主細(xì)胞唾液酸受體(SA)的結(jié)合，而流感病毒的內(nèi)部蛋白影響流感病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制能力。流感病毒神經(jīng)氨酸酶(NA)的主要功能是將子代病毒從宿主細(xì)胞表面釋放出來。

病毒的受體結(jié)合特異性主要決定了病毒對(duì)宿主細(xì)胞的吸附能力與感染能力。不同種屬的宿主或同一宿主的不同組織和細(xì)胞的唾液酸受體(SA)的分布具有特異性。流感病毒吸附宿主首先需要血凝素蛋白(HA)與宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體(SA)結(jié)合。宿主細(xì)胞表面的唾液酸受體(SA)末端的糖鏈的類型(α-2，6糖苷鍵或 α-2，3糖苷鍵)影響了流感病毒對(duì)宿主的結(jié)合能力和感染能力。人流感病毒傾向結(jié)合于主要表達(dá)在上呼吸道細(xì)胞和非纖毛細(xì)胞表面的SAα2，6受體，而禽流感病毒傾向結(jié)合主要表達(dá)于禽的腸上皮細(xì)胞和人的下呼吸道細(xì)胞的SAα2，3受體。具有 SAα2，3受體特性的高致病性禽流感病毒(HPAIV)對(duì)禽類具有較強(qiáng)的毒力，引起急性病毒性肺炎并且有可能進(jìn)一步發(fā)展成急性呼吸窘迫癥(ARDS)以及多器官衰竭。多數(shù)研究者認(rèn)為這與其具有下呼吸道細(xì)胞組織嗜性有一定的關(guān)系。H3系流感病毒的血凝素蛋白(HA)的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)第226位和第228位氨基酸對(duì)于流感病毒的宿主范圍和致病力都具有關(guān)鍵的作用，其主要原因是這兩個(gè)位點(diǎn)決定受體結(jié)合特性。研究發(fā)現(xiàn)，禽流感病毒血凝素蛋白(HA)第226位氨基酸通常是谷氨酰胺(Gln)，其特異結(jié)合 SAα2，3受體；而人 H 2和 H 3流感病毒血凝素蛋白(HA)第226位氨基酸位點(diǎn)通常是亮氨酸，傾向結(jié)合SAα2，6受體。在大多數(shù)人流感病毒中，HA蛋白第226位氨基酸是亮氨酸的同時(shí)第228位氨基酸通常是色氨酸(Ser)；而禽流感中，HA蛋白的第226位和第228位氨基酸通常是谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)。從人或豬體內(nèi)分離到的H 1亞型流感病毒的HA傾向結(jié)合SAα2，6受體，其 HA的第190位氨基酸通常是天冬氨酸(Asp)并且伴隨著第225位氨基酸是谷氨酸(Glu)或天冬氨酸(Asp)；從禽體內(nèi)分離到的H1亞型流感毒株的這兩個(gè)位點(diǎn)分別是谷氨酸(Glu)和甘氨酸(Gly)，其HA易于結(jié)合SAα2，3受體［3］。H5N1亞型高致病性禽流感病毒只識(shí)別SAα2，3受體，但我們發(fā)現(xiàn)當(dāng) HA的160位氨基酸為丙氨酸(A)時(shí)，H5N1病毒可同時(shí)識(shí)別 SAα2，3受體和SAα2，6受體。如果將該位氨基酸由 A突變?yōu)樘K氨酸(T)時(shí)病毒就會(huì)只識(shí)別 SAα2，3受體，進(jìn)一步的分析發(fā)現(xiàn)A160T變異可導(dǎo)致HA增加一個(gè)糖基化位點(diǎn)，從而影響了病毒受體結(jié)合特性［4］。除受體結(jié)合特性外，流感病毒的復(fù)制能力同樣影響著病毒的跨種傳播能力。流感病毒需要利用宿主細(xì)胞的復(fù)制系統(tǒng)幫助其復(fù)制。研究人員發(fā)現(xiàn)A型流感病毒的多聚酶蛋白PB2、PA和基質(zhì)蛋白M 1、M 2均會(huì)影響到流感病毒的復(fù)制能力。

2 模型動(dòng)物的宿主限制性

宿主限制性是造成流感病毒具有不同宿主范圍的因素之一。選擇模型動(dòng)物時(shí)首先要考慮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的宿主限制性，宿主的限制性包括病毒受體和抗病毒天然免疫。

2.1 小鼠

小鼠是用于評(píng)估流感感染最常用的哺乳動(dòng)物模型。大多數(shù)實(shí)驗(yàn)用小鼠的呼吸道表面具有SAα2，6和SAα2，3兩種唾液酸受體［5］，因而對(duì)人、禽流感病毒都易感。但不同的小鼠分布也不完全相同。BALB/c小鼠的多數(shù)器官都表達(dá)SAα2，6和SAα2，3受體，包括氣管、肺、小腦、脾、肝和腎，而C57BL/6J小鼠的肺中缺乏 SAα2，6受體，SAα2，3則被證明存在纖毛孔和肺泡上皮Ⅱ型細(xì)胞上。雖然實(shí)驗(yàn)小鼠可同時(shí)表達(dá)兩種受體，但人A型流感病毒(H1、H2和H3)一般要經(jīng)過在小鼠上適應(yīng)性傳代才能有效復(fù)制，而一些低致病性和高致病性禽流感如H 5N1，H2、H6和H7病毒則不需要適應(yīng)性傳代即可感染。從而可以推斷僅由受體分布并不能完全決定流感病毒的宿主范圍。另一個(gè)宿主限制性因素是Mx1蛋白，Mx1蛋白屬于干擾素誘導(dǎo)蛋白家族，可以通過干擾mRNA合成阻斷流感病毒復(fù)制。大多數(shù)近交系小鼠因攜帶缺陷的Mx1等位基因，對(duì)鼠適應(yīng)流感病毒高度易感［6］。

2.2 雪貂

雪貂一直被視為流感研究的理想動(dòng)物模型。雪貂對(duì)許多種人和禽流感病毒都易感，并且與人在臨床表現(xiàn)、肺功能、氣道形態(tài)、呼吸道細(xì)胞種類等方面有許多相似性。雪貂的呼吸道表面具有SAα2，6和SAα2，3兩種受體，SAα2，6受體分布于呼吸道，SAα2，3受體主要分布在下呼吸道末梢呼吸道細(xì)支氣管［7］。人 H3N2流感病毒的吸附和復(fù)制主要在上呼吸道進(jìn)行，然而禽流感病毒的感染和復(fù)制主要在下呼吸道。人流感病毒吸附在呼吸道纖毛上皮細(xì)胞表面和雪貂I型肺泡細(xì)胞，主要引起上呼吸道疾病偶爾也導(dǎo)致支氣管肺炎。禽流感吸附在Ⅱ型肺泡細(xì)胞和細(xì)支氣管，這可以解釋了禽流感引起肺部的嚴(yán)重病變而氣管和細(xì)支氣管所受影響很少的原因。雪貂的其它宿主限制性因素研究的還相對(duì)較少。有趣的是，人們通過比較發(fā)現(xiàn)自然感染雪貂的鼻洗液中淋巴細(xì)胞應(yīng)答能力比鼻內(nèi)接種感染的雪貂弱［8］。淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)減少和細(xì)胞免疫的暫時(shí)性損傷均會(huì)導(dǎo)致流感病毒對(duì)雪豹的感染能力增強(qiáng)。

2.3 非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物

各種各樣的非人靈長(zhǎng)動(dòng)物，包括舊大陸猴(恒河猴和獼猴)和新大陸猴(卷尾猴)都已用于流感病毒感染研究。與雪貂不同，流感病毒在非人靈長(zhǎng)動(dòng)物吸附模式和在人呼吸道具有顯著的不同；獼猴感染H3N2病毒后，病毒吸附不發(fā)生在氣管、支氣管或細(xì)支氣管。這就可以解釋為什么獼猴感染人H3N2病毒后臨床癥狀不明顯。部分非人靈長(zhǎng)動(dòng)物對(duì)季節(jié)性流感病毒的敏感性降低歸因于非人靈長(zhǎng)動(dòng)物和人類的受體分布不同。我們 H 5N1高致病性流感感染研究中發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)氣管內(nèi)接種，才會(huì)造成病毒性肺炎［9］，單純的經(jīng)鼻腔接種通常只會(huì)形成一過性的感染。

2.4 豚鼠

豚鼠是近年才開始應(yīng)用于流感傳播研究的新模型。豚鼠的鼻腔的呼吸道上皮細(xì)胞的唾液酸受體類型為SAα2，6和 SAα2，3，但以 SAα2，6為主，而嗅部為 SAα2，6受體。氣管上皮細(xì)胞表面同時(shí)具有SAα2，6和 SAα2，3類型的受體。肺上皮細(xì)胞表面為 SAα2，3受體［4］。

3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物在A型流感病毒哺乳動(dòng)物間水平傳播機(jī)制研究中的應(yīng)用

雪貂是最早應(yīng)用于A型流感病毒傳播機(jī)制研究的模型動(dòng)物。但由于雪貂價(jià)格較貴并且飼養(yǎng)條件要求高，應(yīng)用并不廣泛。一些研究者試圖用小鼠作為評(píng)價(jià)模型，但絕大多數(shù)流感病毒都不能在小鼠中傳播，甚至 1918H1N1也未能引起傳播。2006年，Peter Palese［10］發(fā)現(xiàn)豚鼠適合研究流感病毒的傳播。人流感病毒在豚鼠中可以高效傳播(包括接觸性傳播和非接觸性傳播)。體積較小、價(jià)格低廉的豚鼠成為研究流感病毒傳播又一個(gè)重要的哺乳動(dòng)物模型，但和雪貂不同，感染的豚鼠臨床癥狀并不明顯，即使是H5N1亞型高致病性禽流感病毒對(duì)豚鼠也不具有明顯的致病性。

近些年來，通過使用模型動(dòng)物，已發(fā)現(xiàn)了一些影響流感病毒對(duì)哺乳動(dòng)物的跨種感染和傳播的分子機(jī)制。Gao等［11］用豚鼠模型發(fā)現(xiàn)并證明 PB2基因701位點(diǎn)的天冬酰氨是H5N1亞型禽流感病毒在哺乳動(dòng)物中水平傳播的必需前提；并發(fā)現(xiàn)HA基因的160氨基酸由T突變?yōu)锳，導(dǎo)致158-160位糖基化位點(diǎn)缺失，可使H 5N1病毒結(jié)合人的SAα2，6受體，并獲得在哺乳動(dòng)物間的水平傳播能力。Hoeven等［12］研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于 H1N1亞型流感病毒而言，血凝素蛋白(HA)的受體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)的第190位和225位氨基酸對(duì)于不同來源的H1N1流感病毒在雪貂群中空氣傳播能力影響很大。第190位和第225位均為天冬氨酸的人源 H1N1可以在雪貂群中高效的發(fā)生空氣傳播，進(jìn)一步研究還發(fā)現(xiàn)1918H1N1“西班牙流感”病毒PB2蛋白的第627位氨基酸影響其在雪貂中的傳播能力，該點(diǎn)為賴氨酸的1918H1N1流感病毒能夠在雪貂群中高效傳播；當(dāng)該位點(diǎn)突變?yōu)楣劝彼釙r(shí)，突變的1918H1N1流感病毒在雪貂群中的傳播能力明顯減弱。Steel等［13］在研究 PB2蛋白氨基酸位點(diǎn)對(duì)于流感病毒傳播能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，將一株人季節(jié)性流感H 3N2的PB2蛋白第627位氨基酸由賴氨酸突變?yōu)楣劝彼?，突變后的流感病毒與其母本相比，在豚鼠間的空氣傳播能力明顯減弱。除病毒自身的因素外，溫度和相對(duì)濕度對(duì)于生物氣溶膠的傳播影響較大。Palese等［14］利用豚鼠模型研究環(huán)境溫度和相對(duì)濕度對(duì)于流感病毒在豚鼠間傳播能力的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，低溫(5℃)有利于流感病毒在豚鼠間的空氣傳播而高溫阻礙傳播。當(dāng)環(huán)境溫度為20℃時(shí)，低相對(duì)濕度有利于流感病毒在豚鼠間空氣傳播；研究者認(rèn)為不同的相對(duì)濕度影響了流感病毒氣溶膠在空氣中的衰減速度和傳播距離。Hemmes等［15］用直徑在5～6um的流感病毒氣溶膠研究生物半衰期時(shí)發(fā)現(xiàn)，相對(duì)濕度小于40%時(shí)流感病毒氣溶膠的衰減速度最慢，并且其衰減速度隨著相對(duì)濕度的升高而加快。不僅如此，Schaffer等［16］發(fā)現(xiàn)相對(duì)濕度對(duì)于流感病毒氣溶膠的穩(wěn)定性有一定影響，流感病毒氣溶膠在相對(duì)濕度為20%時(shí)粒子穩(wěn)定性最高；在相對(duì)濕度為50% ～60%之間時(shí)穩(wěn)定性最差；而在高相對(duì)濕度時(shí)居中。Lowen等［17］用豚鼠模型證明了高溫(30℃)可以阻斷流感病毒氣溶膠在任何相對(duì)濕度下的空氣傳播，但是并不能阻斷流感病毒在豚鼠間的接觸性傳播或飛沫傳播。研究者認(rèn)為，流感病毒在熱帶地區(qū)和亞熱帶地區(qū)的反復(fù)不定期流行的一個(gè)原因可能是發(fā)生在此地區(qū)的流感病毒主要是以接觸性傳播或飛沫傳播為主，而溫帶地區(qū)的流感主要以空氣傳播為主，因此更易發(fā)生季節(jié)性流感。

4 結(jié)語：

通過使用模型動(dòng)物，人們對(duì)流感病毒傳播機(jī)制的認(rèn)識(shí)和理解在逐漸加深。但現(xiàn)有的模型還不能完全滿足傳播機(jī)制研究的需要，還需要更廣泛的選用模型。如雪貂因?qū)α鞲羞^于敏感而在實(shí)驗(yàn)中難于控制，豚鼠感染流感后不表現(xiàn)臨床癥狀而無法全面模擬病毒在人與人之間傳播的現(xiàn)象。此外，目前發(fā)現(xiàn)的一些影響傳播的病毒氨基酸并不具有普遍的代表性，說明病毒的傳播受多基因和多因素的影響，還需要進(jìn)一步的研究。

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