神經(jīng)組織染色方法的研究概況

顧 兵，金建波，李華南，王爍宇

(1.江西科技師范學院，江西 南昌 330013;2.江西中醫(yī)學院，江西南昌 330006)

神經(jīng)退行性疾病(neurodegenerative diseases)是由大腦或脊髓的神經(jīng)元或其髓鞘的喪失所致，隨著時間的推移而惡化，以導致功能障礙［1］。采用常規(guī)染色技術，如HE染色，疾病的某些特殊病理變化難以完全準確的顯現(xiàn)，而借助一些特殊染色可對某一特定結構改變進行選擇性的浸染。但是，由于后者染色步驟過于復雜，流程相對繁瑣，受外界因素的干擾比較大，經(jīng)常導致染色結果的不穩(wěn)定，進而難以反映病理改變。目前，系統(tǒng)介紹神經(jīng)組織染色技術進展的文獻甚少，使得神經(jīng)病理學研究人員，尤其是初學者，難以領會各種染色方法的精髓。根據(jù)浸染組織的不同，將神經(jīng)組織染色分為尼氏染色、神經(jīng)元染色、神經(jīng)膠質細胞染色、髓鞘染色、突觸染色和神經(jīng)纖維染色6種。本文就發(fā)展成熟的神經(jīng)組織染色方法原理、優(yōu)缺點及其病理學應用作一綜述，并簡述其在神經(jīng)退行性疾病研究中的應用，旨在指導研究者選用合適的染色方法。

1 尼氏染色(Nissl staining)

尼氏染色方法是德國病理學家Nissl于1892年創(chuàng)立，其主要根據(jù)是神經(jīng)元胞體內(nèi)含有大量嗜堿性的尼氏小體。當組織與某些堿性染料(甲粉紫、甲苯胺藍、硫堇、焦油紫等)作用時，細胞中的尼氏體能夠選擇性與其結合而著色。Lindroos［2］對尼氏染色方法進行了改良，并應用于顱腦組織切片的病理研究。改良后的方法大大縮短了染色時間，且胞內(nèi)細胞核，尼氏體均能清晰可見。雖然尼氏染色法既可清晰辨別尼氏體以及胞核、核仁［3］，又很容易區(qū)分軸突和樹突，但該法僅應用于腦，脊髓等尼氏體較為豐富的組織。尼氏體受染后呈塊狀(形如虎斑)或顆粒狀，核周圍尼氏體顆粒較大，近邊緣處較小而細長。在神經(jīng)元受損時，尼氏體的數(shù)量可減少甚至消失，因此根據(jù)形狀大小和數(shù)量差異，可判別神經(jīng)損傷程度。Simon等［4］報道促紅細胞生成素對豬缺血/再灌注損傷的治療作用。經(jīng)尼氏染色、HE染色和TUNEL免疫組化染色證實，脊髓胸段神經(jīng)元損傷以及凋亡得到緩解。Pinzon等［5］分別采用動物行為學和尼氏染色評價二甲胺四環(huán)素對脊髓挫傷大鼠的神經(jīng)保護作用。施用二甲胺四環(huán)素后，大鼠BBB評分和組織病理學均有改善。缺點是組織未干燥完全，易發(fā)生嚴重皺縮。其次，切片之后易使組織破裂，影響觀察。

2 神經(jīng)元染色(neuron staining)

神經(jīng)元染色主要分為鍍銀染色和FJ染色(Fluoro jade staining)兩種方法。鍍銀染色是由Golgi于1873年建立并成功應用于神經(jīng)元的特異性染色技術。由于神經(jīng)元具有較強的嗜銀性，當組織處于含有銀離子的溶液中，神經(jīng)元可選擇性地浸染銀離子。然后通過甲醛溶液可將沉積在組織中的銀離子還原為銀顆粒，從而使神經(jīng)元著色。但是，Golgi法只能浸染所有神經(jīng)元細胞，難以辨別潰變的神經(jīng)元。Carlsen等［6］發(fā)現(xiàn)組織切片經(jīng)過銅銀溶液浸染后，正常神經(jīng)元被抑制染色，從而區(qū)分出潰變神經(jīng)元，且染色結果背景清晰，潰變神經(jīng)元及其軸突結構完整。Tenkova等［7］在此基礎上對鍍銀染色進行了改進，使組織切片在4%多聚甲醛溶液中保存時間延長至6個月，仍具較好染色效果，染色結果背景呈金黃色。因而，該方法在神經(jīng)退行性疾病研究方面被諸多學者所親睞。Hall等［8］利用銅銀染色技術對控制性皮層撞擊小鼠進行定量影像分析，同時對神經(jīng)元退變程度的空間性和時程性作了比較完整的闡述。Macauley等［9］報道了PPT1(一種棕櫚蛋白質硫酯酶)缺陷小鼠的小腦病理和運動障礙的結果。經(jīng)過銅銀染色后，發(fā)現(xiàn)PPT1缺失后大鼠神經(jīng)元退變程度明顯增加。但由于試劑成本較高，染色步驟較為繁瑣，耗時較長，不宜批量制作標本，并且所需器皿均需潔凈，否則影響染色結果。此外該染色技術通常采用多聚甲醛溶液及二甲胂酸緩沖液對標本進行灌注固定，且固定時間均需完全，否則神經(jīng)元不易被浸染或浸染不完全［10］，因此國內(nèi)報道較少。

FJ染色是近年來新興的一種神經(jīng)元染色技術［11］。Fluoro Jade染料對變性神經(jīng)元具有很高親和力，在紫外線照射條件下，壞死神經(jīng)元顯現(xiàn)藍色熒光，由此對損傷神經(jīng)元進行定性，定量研究。FJ染色不僅可選擇性地標記腦及脊髓組織切片上變性神經(jīng)元的胞體、樹突和軸突，而且能顯示腦內(nèi)神經(jīng)細胞凋亡和組織中淀粉樣蛋白沉積。FJ染色除了能浸染潰變神經(jīng)元外，還可以用于退變有髓纖維束的追蹤，如視神經(jīng)束等。目前用于退變神經(jīng)元染色的FJ染料主要有FJ、FJB和FJC三種。與FJ和 FJB染料相比［12］，F(xiàn)JC染料效果更優(yōu)，親和力更高，染色時間短，所需濃度低。此外，其還可與其它熒光素標記物結合進行多重熒光染色。Chidlow等［13］采用FJC和DAPI(一種能夠與DNA強力結合的熒光染料)熒光雙染技術評價大鼠視網(wǎng)膜和視神經(jīng)纖維損傷后神經(jīng)元退變情況。Mechírová 等［14］探討脊髓缺血/再灌注后神經(jīng)元退變，試驗前預先施用去甲腎上腺素和銀杏葉乙醇提取物EGb761的家兔，F(xiàn)JB染色結果發(fā)現(xiàn)缺血/再灌注后大鼠脊髓側角Ⅶ，Ⅷ，Ⅸ對陽性神經(jīng)元明顯下降。

3 神經(jīng)膠質細胞染色(Glial staining)

3.1 星形膠質細胞 Cajal法染色是一種選擇性浸染星形膠質細胞的染色技術。原理是切片經(jīng)氯化金升汞溶液浸染，然后通過亞硫酸鈉溶液使星形膠質細胞著色穩(wěn)定。缺點是染液需臨用前配制，不易保存，染色耗時長，染色結果不穩(wěn)定。Kitch等［15］建立的星形膠質細胞染色方法，能選擇性地浸染原生質型或纖維型星形膠質細胞的胞體，而對其他膠質細胞的浸染具有抑制作用。但對于Ⅱ型阿爾采末病引起的星形膠質細胞病變狀態(tài)難以浸染。楊壯來在Cajal法染色的基礎上對組織的切片，固定，浸染等步驟進行了修改。改良后的方法使纖維型星形膠質細胞染色均勻，背景淺，染色時間明顯縮短。許多神經(jīng)退行性疾病，如帕金森病、阿爾采末病，常與腦內(nèi)神經(jīng)細胞，尤其是星形膠質細胞的損傷(或退化)，腦中神經(jīng)纖維叢的出現(xiàn)以及類淀粉斑有關。鄧廣斐等采用將神經(jīng)毒素MPTP注入C57BL/6小鼠腹腔建立帕金森病動物模型。經(jīng)碳酸銀染色發(fā)現(xiàn)，帕金森病模型組星形膠質細胞增生與激活明顯。

3.2 小膠質細胞 1963年Naoumenko等報道采用碳酸銀法浸染小膠質細胞，再經(jīng)過甲醛溶液還原使銀沉積在組織切片上。與常規(guī)HE染色相比，碳酸銀染色能夠顯現(xiàn)出胞體及其突起。但碳酸銀見光易分解，不易保存。但后來Gallyas報道的銀染法具有組織可于甲醛溶液中保存數(shù)年，適用于多種標本的取材，包括冰凍切片、石蠟切片等，可批量進行染色操作，浸染過程可在鏡下操作便于控制染色時間等優(yōu)點。鄭翔等將組織標本由原來的火棉膠處理改為石蠟處理。雖然準確穩(wěn)定的浸染出小膠質細胞，但仍存在一些缺陷，如切片厚度不能太厚，背景過深等。于騰波等探討活化的小膠質細胞移植治療大鼠脊髓中度損傷的療效。碳酸銀染色和BBB評分結果顯示:移植組比同期對照組陽性細胞數(shù)明顯增多，移植組術后后肢運動功能評分較對照組明顯升高。

3.3 少突膠質細胞 少突膠質細胞染色原理與其他鍍銀染色技術相類似，主要依據(jù)神經(jīng)細胞嗜銀性。1930年Penfield采用Del Rio-Hortega’s改良法成功浸染出少突膠質細胞。該法對脊髓，腦干及顱腦白質區(qū)域的少突膠質細胞浸染可靠性好，并且還可選擇性浸染外周神經(jīng)施萬細胞的髓鞘，但染色背景較粗糙，影響觀察。1948年Grino等將鎢酸鈉添加至硝酸銀溶液中，使少突膠質細胞的呈現(xiàn)更為清楚。少突膠質細胞對氧具有特殊的親和力，經(jīng)過過氧化氫溶液處理后，激活了少突膠質細胞內(nèi)的碳酼基而發(fā)生顯色反應。但此法對于細胞突起的顯示不夠清晰，操作比較繁瑣。姚竹秀將Grino法進行改進，采用Peufield染色法所用的固定劑固定組織，得到較好的染色結果，并認為固定劑成分和酸堿度對染色的成敗大有關系。馬廷賢將銀溶液中的碳酸鈉濃度調至飽和，用DAB和H2O2對切片進行預處理，同時把浸染的時間延長和溫度升高，染色結果穩(wěn)定性和成功率大為提高。細胞形態(tài)顯現(xiàn)的原因可能是DAB對銀離子具有吸附作用，使其在膠質細胞的胞體和突起上沉積而顯色。

4 髓鞘染色(myelin staining)

髓鞘是包裹在神經(jīng)細胞軸突外面的一層膜。神經(jīng)纖維受損時，如多發(fā)性硬化癥，腦脊髓炎等疾病均可導致髓鞘的變形，崩解或脫失。目前常用髓鞘染色方法有媒染法，利用鋨酸與類脂質的特殊反應和油溶性染料浸染法3種。媒染法主要是因為經(jīng)鉻鹽或鐵礬媒染的磷脂(髓鞘主要成分)易與蘇木素結合而著色，具有操作簡單，試劑便宜的優(yōu)點。但染色結果對比度差、且分化不易掌控，較難被初學者所掌握。鋨酸與類脂質的特殊反應主要原理是:將類脂質組織(磷脂)固定于鋨酸溶液后，能被氧化成黑色體，由此特異性鑒別髓鞘。經(jīng)鋨酸固定后的類脂質組織不會被脂溶性溶劑溶解，提高了結果準確性。但鋨酸價格昂貴，且不易久存;其次因浸透性差，經(jīng)常造成組織背景模糊，不易觀察。油溶性染料主要是指Luxol固藍，是Kluver等［16］于1953年將其應用于髓鞘染色。Luxol固藍在乙醇溶液內(nèi)具有與髓鞘磷脂結合染色的特性，如再經(jīng)過中性紅或焦油紫復染，不僅對髓鞘著色有一定的強化效應，而且還可浸染神經(jīng)元的胞核及尼氏體。Luxol固藍染色能夠浸染髓鞘束和單一髓鞘纖維，髓鞘著色鮮明，背景清晰。呂廣明認為該法對于鑒定神經(jīng)髓鞘的特異性具有良好的標記作用，常用于顯示髓鞘含量豐富的神經(jīng)傳導束，如皮質脊髓束。此外，也可用來分析髓鞘再生及脫髓鞘的程度［17］。與媒染法、鋨酸染色法相比，對比度明顯提高，特異性好，但試劑較貴，不易購買。在研究神經(jīng)退行性疾病中，髓鞘染色通常與尼氏染色相結合，使結果對比鮮明。Chen等［18］探討3，4二羥苯基乳酸(DLA)對脊髓壓迫損傷后的炎癥影響。Luxol固藍和Nissl染色結果顯示，經(jīng)DLA施用后的大鼠，傷后d 10髓鞘退變緩慢。朱桂彬等利用改良的Marsland銀染法與Luxol固藍雙重染色觀察人老年癡呆癥尸檢腦組織。結果發(fā)現(xiàn)腦組織中老年斑呈均質的嗜銀團，神經(jīng)元纖維增粗，扭曲形成纏結清晰可見，且染色背景清晰，幾無銀顆粒沉淀。

5 突觸染色(synapse staining)

目前有兩種顯示神經(jīng)突觸的方法。鍍銀染色法通常采用Cajal染色法和Golgi染色法來顯示突觸，其主要根據(jù)突觸的嗜銀性而使突觸著色［19］。但由于過程繁瑣，染色結果不穩(wěn)定而未被廣泛使用。Singh［20］通過改良鍍銀染色發(fā)現(xiàn)，大鼠傷后d 7即可在神經(jīng)纖維網(wǎng)齒狀回觀察到少量退變突觸。楊壯來將Cajal法進行改良并成功顯示神經(jīng)突觸。改良后的方法具有神經(jīng)突觸及包體內(nèi)神經(jīng)元纖維染色清晰，方法簡單，穩(wěn)定，切片可長久保存而不退色的特點。磷鎢酸染色法是利用重金屬浸染神經(jīng)突觸，然后通過電鏡觀察突觸結構及數(shù)量變化。缺點是組織固定時需采用鋨酸，毒性較強，且價格昂貴。Shankar等［21］通過磷鎢酸染色證實，突觸結構及機能的可塑性變化與學習，記憶功能有著密切聯(lián)系。韓玉澤等借助磷鎢酸染色電鏡觀察患有克汀病的大鼠小腦突觸分布，發(fā)現(xiàn)顆粒層中突觸數(shù)目較少，且形成不全。

6 神經(jīng)纖維染色(nerve fiber staining)

神經(jīng)纖維染色也是依據(jù)神經(jīng)纖維對銀離子的特殊吸附性，但方法不同。1904年Bielschowsky等通過甲醛溶液將吸附于神經(jīng)纖維內(nèi)的銀復合物還原生成棕黑色鉻銀沉淀，但難以浸染潰變的神經(jīng)纖維。Fink等［22］將組織切片依次浸入高錳酸鉀、草酸和苯二酚混合液、硝酸鈾進行預處理，選擇性浸染出潰變的神經(jīng)纖維。但由于銀顆粒易在正常組織中沉積，造成切片背景不清晰、潰變纖維及其終末不易辨別的缺陷。隨后，De Olmos［23］將組織切片先經(jīng)銅銀溶液處理，抑制正常神經(jīng)纖維浸染。該法具有染色背景清晰，潰變纖維結構明顯可見的特點。畢彥忠等將氨銀溶液的配置方式進行簡化，使神經(jīng)纖維浸染及背景更為清晰，同時操作簡單，節(jié)省試劑成本。此外，何金鑫等報道固定液的選擇對神經(jīng)纖維染色有一定的影響，其中丙酮固定后染色效果最好。Gallyas［24］將潰變神經(jīng)纖維染色法應用于阿爾采末病等神經(jīng)退行性疾病的病理診斷研究。與Bodian染色法相比，該法可抑制正常神經(jīng)組織浸染，僅對神經(jīng)元纖維纏結、膠質細胞變性，包涵體等異常結構選擇性染色。

神經(jīng)退行性疾病除了引發(fā)神經(jīng)組織自身受損外，亦會引起一些神經(jīng)毒性物質和蛋白的異常表達。如Tau蛋白、GFAP和CR3分別為少突膠質細胞、星形膠質細胞及小膠質細胞受損的特異性標識物［25］。髓鞘堿性蛋白(MBP)是由少突膠質細胞分泌。當MBP大量丟失會引起髓鞘受損，進而引起軸突受損。因此，除了神經(jīng)組織染色技術外，免疫組織化學，免疫沉淀反應等技術同樣在顯示其病變結構研究中扮演著重要角色。它是利用抗原抗體反應與形態(tài)學結合，對組織中的抗原做定性、定量、定位檢測，具有操作簡單，靈敏度高的特點。缺點是抗原活性容易丟失，或者存在非特異性染色而影響結果判定?？偠灾?，一種準確、可靠的神經(jīng)組織染色方法，需要具備被染對象特異性高、操作簡便、試劑價格低廉、無毒、靈敏度高及穩(wěn)定性好等特點。

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