• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    鞘內(nèi)注射巴氯酚對神經(jīng)病理性痛大鼠的鎮(zhèn)痛作用及其對脊髓GABA轉(zhuǎn)運體-1的影響

    2011-12-08 06:58:16朱珊珊譚珊珊曾因明
    中國藥理學(xué)通報 2011年10期
    關(guān)鍵詞:背角鞘內(nèi)神經(jīng)病

    朱珊珊,譚珊珊,,曾因明

    巴氯酚(baclofen,Bac)是 GABAB受體的激動劑,在脊髓的中間神經(jīng)元可產(chǎn)生突觸前和突觸后抑制效應(yīng)。在行全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的患者鞘內(nèi)使用巴氯酚,可減少阿片類藥物的用量和慢性疼痛的形成[1]。目前的研究認為,巴氯酚的鎮(zhèn)痛作用可能與其促進抑制疼痛信息傳遞的遞質(zhì)如GABA、內(nèi)啡肽的釋放有關(guān)[2],但具體機制還不清楚。GABA轉(zhuǎn)運體(GABA transporter,GAT)能夠高效地將突觸間隙的GABA轉(zhuǎn)運回細胞內(nèi),從而終止GABA的突觸后效應(yīng),因此GAT數(shù)目和功能的改變將直接影響間隙內(nèi)GABA的含量。已有研究表明,大鼠脊髓水平GAT-1表達的上調(diào)參與神經(jīng)病理性疼痛的形成。巴氯酚的鎮(zhèn)痛作用是否與其對GAT-1的影響有關(guān),目前還不清楚。因此,本研究在坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠模型上,采用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)和Western blot方法,觀察鞘內(nèi)應(yīng)用GABAB受體激動劑巴氯酚對神經(jīng)病理性痛大鼠觸誘發(fā)痛、熱痛敏等特征性痛覺行為學(xué)反應(yīng)和脊髓GAT-1蛋白表達的影響,以探討巴氯酚對神經(jīng)病理性痛的鎮(zhèn)痛作用及其可能機制。

    1 材料與方法

    1.1 神經(jīng)病理性疼痛動物模型的制備 慢性坐骨

    神經(jīng)結(jié)扎損傷(chronic constriction injury,CCI)致神經(jīng)病理性痛大鼠模型[3]的制備 SD♂大鼠,(250±20)g,飼養(yǎng)1周。戊巴比妥鈉40 mg·kg-1腹腔注射后,選擇左側(cè)后肢,消毒皮膚,切開皮膚,分離皮下及肌肉,暴露坐骨神經(jīng),以3-0絲線相隔1 mm松結(jié)扎4道,直到神經(jīng)外膜稍稍收壓為止,打結(jié)時可見左下肢肢體輕微抽動。逐層縫合。假手術(shù)組步驟與神經(jīng)結(jié)扎大鼠相同,但只暴露神經(jīng),而不加結(jié)扎。

    1.2 鞘內(nèi)給藥方法 將大鼠頭置于麻醉箱內(nèi),吸入0.4 ml異氟烷。一手定位大鼠L5-6腰椎棘突,16 G粗針破皮,另一手持25 μl微量注射器,按 Mestre等[4]報道的方法刺入蛛網(wǎng)膜下腔,出現(xiàn)典型鼠尾側(cè)向甩動和抖動視為穿刺成功。藥物均溶于10 μl生理鹽水中,于10 s內(nèi)推完。停止吸入異氟烷后動物將在1 min內(nèi)恢復(fù)翻正反射。巴氯酚〔R(±)baclofen〕購自美國Sigma公司。

    1.3 動物分組 行為學(xué)實驗部分,采用結(jié)扎大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)的方法建立神經(jīng)病理痛模型,神經(jīng)結(jié)扎后d 3出現(xiàn)痛覺過敏的大鼠32只隨機分為4組(n=8):Bac1組、Bac2組、Bac3組、NS組,鞘內(nèi)分別注射10 μl的 0.1、0.3、1.0 μg 巴氯酚、生理鹽水。分別于給藥前、給藥后 0.5、1、2、4、8、12、24 h 測大鼠機械刺激縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold,MWT)和熱刺激縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency,TWL)以及運動功能。免疫組織化學(xué)實驗部分,大鼠分為NS組與Bac組,鞘內(nèi)分別給予0.3 μg 巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl,分別于給藥前、給藥后1、4、8 h取大鼠脊髓腰段,用免疫組織化學(xué)方法檢測脊髓節(jié)段GAT-1免疫陽性染色的灰度值。Western blot實驗部分,SD大鼠分為NS組與Bac組,鞘內(nèi)分別給予 0.3 μg巴氯酚(10 μl)或生理鹽水10 μl,分別于給藥前、給藥后30 min、1、2、4、8、12 和 24 h 取大鼠脊髓腰段,用 Western blot方法測定脊髓節(jié)段GAT-1蛋白含量。

    1.4 行為學(xué)指標的測定

    1.4.1 機械縮足反射閾值(mechanical withdrawl threshold,MWT)的測定 按Chaplan等[5]報道方法測定MWT。置大鼠于透明的有機玻璃箱中,底為(0.5×0.5)cm2的鐵絲網(wǎng)。實驗前使之適應(yīng)30 min。以不同折力(buckling force)的Von Frey纖毛(Stoelting公司,美國)刺激大鼠足底。從2.0 g開始,以up-down法推測閾值,并在閾值上下各刺激5次,用內(nèi)推法算出50%反應(yīng)閾值(即引起5次試驗中2.5次反應(yīng)的值)。最大折力為15 g,大于此值時記為15 g。每次實驗至少間隔15 s,并等刺激引起的行為反應(yīng)(如舔足等)完全消失后再給予下一次刺激。

    1.4.2 熱縮足反射潛伏期(thermal withdrawl latency,TWL)的測定 將有機玻璃箱置于3mm厚的玻璃板上,將大鼠放入有機玻璃箱內(nèi),使其自由活動30 min以適應(yīng)測試環(huán)境和溫度。室溫穩(wěn)定在25℃±1.0℃。按 Hargreaves等[6]法用 BME-410A 型熱痛刺激儀(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院生物醫(yī)學(xué)研究所制作)照射大鼠足底。照射開始至大鼠出現(xiàn)抬腿回避時間為TWL。刺激部位為緊貼玻璃板的后爪部分。當后爪移動時,停止照射。照射自動切斷時間為20 s,以防止組織損傷。整個實驗中,熱刺激強度保持相同。重復(fù)刺激5次,取后3次TWL的平均值[7]。

    1.4.3 運動功能評分 為了評定和排除藥物對大鼠運動功能的影響,給藥后觀察動物運動情況并根據(jù)下述情況進行評分[8]:0分:沒有運動改變,正常的行走;1分:輕度運動功能減弱,對足底的刺激縮爪反應(yīng)正常;2分:自主活動減弱,中度運動功能減弱,正常行走,對足底的刺激有縮爪反應(yīng),但減弱;3分:不能自主活動,不能行走,對足底的刺激沒反應(yīng)。評分≥2,表示有明顯的運動功能障礙。

    1.5 免疫組織化學(xué)染色 大鼠在戊巴比妥鈉(40 mg·kg-1)腹腔注射麻醉下行左心室穿刺灌注,取腰段脊髓,4%多聚甲醛后固定。行連續(xù)冰凍切片,切片厚度為40 μm,每間隔5張取1張,收集在0.01 mol·L-1PBS液中。切片沖洗孵育后,加入GAT-1一抗(1∶300)。4℃孵育48 h后用PBS洗去未結(jié)合的一抗,順序加入工作液。以上各步驟均用0.01 mol·L-1PBS徹底漂洗切片,最后用即用型DAB顯色,干燥,脫水,透明,中性樹膠封片。每只動物隨機取脊髓片3張,高倍鏡下以O(shè)lympus DP11數(shù)碼相機在脊髓背角截取一屏,以Leica圖像分析系統(tǒng)對上述部位GAT-1的染色灰度進行分析。

    1.6 Western blot 戊巴比妥鈉麻醉大鼠,取腰段脊髓放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。提取胞膜蛋白,?0 μg蛋白樣本SDS聚丙烯酰胺凝膠上電泳,然后電轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜上,與GAT-1一抗(1∶300)孵育過夜,加入兔二抗(1∶500),孵育沖洗,用NBT/BCIP進行呈色反應(yīng),反應(yīng)條帶進行定量分析。

    2 結(jié)果

    各組大鼠基礎(chǔ) MWT分別為:(13.2±1.7)g、(12.9±1.9)g、(13.5±1.4)g、(13.4 ±1.5)g;基礎(chǔ)TWL分別為:(14.2±3.9)s、(15.4±4.0)s、(16.1±3.8)s、(15.5 ±4.3)s。坐骨神經(jīng)結(jié)扎后 d 3,各組大鼠的MWT分別降低為:(4.2±2.1)g、(4.9±2.7)g、(4.5±1.7)g、(4.5±1.7)g;TWL 分別縮短為:(6.8 ±2.4)s、(6.6 ±1.6)s、(7.4 ±1.9)s、(7.42±2.7)s;均明顯低于各自的基礎(chǔ)值(P<0.01)。

    2.1 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)松結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠MWT和TWL的影響 鞘內(nèi)分別注射0.1、0.3、1 μg 巴氯酚后0.5 ~2 h,Bac1 組、Bac2 組與Bac3組大鼠MWT和TWL均較NS組明顯升高(P <0.01,P <0.05),鞘內(nèi)給藥后4 h,Bac2與 Bac3組大鼠MWT和TWL仍較 NS組明顯升高(P<0.01,P<0.05),但Bac1組與NS組相比無差別(P>0.05),給藥后 8 h,Bac1組與 Bac2組 MWT與TWL均降至給藥前水平,但Bac3組MWT與TWL仍高于NS組(P>0.05)。見Tab 1,2。

    2.2 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠運動功能的影響 鞘內(nèi)分別注射0.03、0.3 μg巴氯酚后,大鼠均能保持自主活動,對足底的刺激反應(yīng)靈敏,運動功能評分均為0或1。鞘內(nèi)注射1 μg巴氯酚后,在該實驗組的8只動物中有5只大鼠出現(xiàn)不同程度的自主運動障礙,運動功能評分均≥2,持續(xù)時間約為15~30 min。

    2.3 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓背角GAT-1免疫陽性神經(jīng)元的影響

    與NS組比較,鞘內(nèi)注射0.3μg巴氯酚后1、4 h,大鼠脊髓背角淺層GAT-1免疫陽性染色灰度值明顯降低(P<0.01,P<0.05);給藥后8 h,Bac組脊髓背角淺層GAT-1染色灰度雖然降低,但與NS組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見Fig 1。

    Fig 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 in spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(×100)

    2.4 鞘內(nèi)注射巴氯酚對坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠脊髓GAT-1蛋白含量的影響 與NS組和給藥前比較,鞘內(nèi)注射0.3 μg巴氯酚后0.5~4 h,大鼠脊髓節(jié)段的GAT-1蛋白含量均明顯降低(P<0.01,P <0.05),至給藥后 8 h,GAT-1 的表達逐漸增多,與NS組和給藥前相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見Tab 3。

    3 討論

    目前認為,巴氯酚可激活突觸前GABAB受體使背根節(jié)C及Aδ纖維傳入神經(jīng)動作電位時程縮短,Ca2+電流減小,復(fù)極化過程加快,一方面可抑制致痛物質(zhì),如P物質(zhì)、谷氨酸等興奮性氨基酸的釋放;另一方面,巴氯酚可促進抑制疼痛信息傳遞的遞質(zhì)如GABA、內(nèi)啡肽的釋放。但目前還不清楚巴氯酚促進GABA釋放的機制。

    Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g,ˉ±s,n=8)

    Tab 1 Effects of intrathecal injection of baclofen on mechanical withdrawl threshold in neuropathic rats with chronic constriction injury(g,ˉ±s,n=8)

    *P <0.05,**P <0.01 vs NS group;#P <0.05,##P<0.01 vs the baseline values

    0.5 1 2 4 8 12 24 NS 4.2 ±2.1 5.9 ±2.8 5.1 ±1.2 3.9 ±2.0 4.1 ±2.4 4.Group Baseline Post-injection/h 4 ±1.8 4.2 ±1.2 4.0 ±1.9 Bac1 4.9 ±2.6 13.2 ±2.6**## 12.3 ±3.8**## 8.1 ±3.3**# 4.9 ±1.7 3.2 ±0.8 4.0 ±2.1 3.3 ±2.4 Bac2 4.5 ±1.7 13.5 ±2.3**## 12.9 ±4.5**## 11.4 ±3.2**## 7.1 ±2.2*# 5.2 ±1.1 5.2 ±1.3 4.8 ±1.3 Bac3 4.5 ±1.9 12.3 ±2.2**## 12.4 ±1.8**## 12.8 ±2.0**## 8.3 ±3.5*# 7.8 ±2.7**#5.9 ±1.1 3.8 ±2.2

    Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s,n=8)

    Tab 2 Effects of intrathecal injection of baclofen on the thermal withdrawl latency in neuropathicrats with chronic constriction injury(s±s,n=8)

    *P <0.05,**P <0.01 vs NS group;#P <0.05,##P<0.01 vs the baseline values

    24 NS 6.8 ±2.4 5.2 ±2.2 7.1 ±1.5 6.4 ±2.5 7.3 ±2.7 6.Group Baseline Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 3 ±1.9 6.8 ±1.3 7.7 ±2.5 Bac1 6.5 ±1.6 18.2 ±4.2**## 11.67 ±3.7**## 9.1 ±1.8*## 6.4 ±2.2 5.7 ±1.5 6.2 ±2.6 6.9 ±2.2 Bac2 7.4 ±1.9 17.5 ±4.0**## 18.2 ±5.3**## 15.9 ±3.8**## 10.9 ±2.8*# 7.0 ±1.8 7.4 ±1.5 6.5 ±1.6 Bac3 7.4 ±2.7 16.8 ±3.7**## 17.9 ±4.8**## 16.6 ±4.2**## 13.6 ±3.3**##10.8 ±2.3**#8.6 ±1.9 6.6 ±3.1

    Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline,ˉ ± s,n=4)

    Tab 3 Effects of intrathecal injection of baclofen on the expression of GAT-1 proteinin spinal cord of neuropathic rats with chronic constriction injury(%of Baseline,ˉ ± s,n=4)

    **P<0.01 vs NS group;△P<0.05,△△P<0.01 vs the baseline values;##P<0.01 vs Pre-injection values

    Group Baseline Pre-injection Post-injection/h 0.5 1 2 4 8 12 24 NS 100±0 179±29△△ 172±18△△ 165±23△△ 181±35△△ 175±26△△ 168±27△△ 174±25△△ 169±24△△Bac 103±24 182±31△△ 116±17**##95±16**## 107±19**##100±23**## 149±21△ 159±26△ 165±30△

    本實驗在坐骨神經(jīng)結(jié)扎致痛覺過敏大鼠鞘內(nèi)給予巴氯酚,能抑制大鼠的觸誘發(fā)痛和熱痛覺過敏,其鎮(zhèn)痛效應(yīng)的持續(xù)時間隨劑量的增加而延長,0.3 μg巴氯酚可提供至少4 h的鎮(zhèn)痛。在本實驗所用的三個劑量中,1.0 μg的巴氯酚雖然鎮(zhèn)痛效應(yīng)持續(xù)時間較其它兩個劑量的作用時間長,但是其對大鼠的運動功能影響較大。在該實驗組中,部分大鼠的運動功能評分≥2,出現(xiàn)了不同程度的自主運動障礙和對足底刺激反應(yīng)降低,表明大劑量的GABAB受體激動劑對大鼠的運動功能有一定影響,這也是GABAB受體激動劑用于臨床鎮(zhèn)痛受限制的原因之一。

    在本實驗中,鞘內(nèi)給予0.3 μg巴氯酚后,大鼠脊髓背角淺層GAT-1樣免疫陽性染色灰度明顯降低,表明GAT-1的表達明顯減少,且與NS組及給藥前比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。0.3μg巴氯酚使GAT-1表達減少的效應(yīng)持續(xù)至給藥后4 h,至給藥后8 h,脊髓背角淺層GAT-1的表達逐漸升高,但與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義,這與該劑量在神經(jīng)病理性痛大鼠模型上的鎮(zhèn)痛效應(yīng)持續(xù)時間是一致的,提示鞘內(nèi)注射巴氯酚可能通過調(diào)節(jié)脊髓水平GAT-1的表達來發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用。最近有研究發(fā)現(xiàn)[9],GAT可與鈣/鈣調(diào)蛋白依賴激酶Ⅱ以及谷氨酸脫羧酶(GAD)形成復(fù)合體,共同調(diào)節(jié)GABA的合成與釋放。Kang等[10]研究證實,在沙土鼠的海馬,GABAB受體的激活可使囊泡GABA轉(zhuǎn)運體(VGAT)減少,減少突觸前GABA的釋放,增加突觸間隙GABA的含量。因此推測在本實驗中,巴氯酚可能通過激活了突觸前的自身 GABAB受體,使脊髓背角GAT-1的含量降低,減少GABA的重攝取,進而增加突觸間隙GABA的含量,從而抑制疼痛信息的傳遞。

    綜上所述,鞘內(nèi)注射GABAB受體激動劑巴氯酚可減輕坐骨神經(jīng)結(jié)扎致神經(jīng)病理性痛大鼠的痛覺過敏,其鎮(zhèn)痛作用可能與抑制脊髓水平GABA轉(zhuǎn)運體-1的表達有關(guān)。

    [1] Sanders J C,Gerstein N,Torgeson E,Abram S.Intrathecal baclofen for postoperative analgesia after total knee arthroplasty[J].J Clin Anesth,2009,21(7):486-92.

    [2] Chung K M,Kim Y H,Song D K,et al.Differential modulation by baclofen on antinociception induced by morphine and beta-endorphin administered intracerebroventricularly in the formalin test[J].Neuropeptides,1999,33(6):534 -41.

    [3] 馬 騁,李翠賢,易建良,閆麗萍.不同材料制備大鼠神經(jīng)病理性疼痛CCI模型的比較[J].中國藥理學(xué)通報,2008,24(4):555-7.

    [3] Ma C,Li C X,Yi J L,Yan L P.Comparision of the chronic constriction injury of the sciatic nerve(CCI)models performed by different materials in neuropathic pain of rats[J].Chin Pharmacol Bull,2008,24(4):555 -7.

    [4] Mestre C,Pelissier T,F(xiàn)ialip J,et al.A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats[J].J Pharmacol ToxicolMethods,1994,32(4):197 -200.

    [5] Chaplan S R,Bach F W,Pogrel J W,et al.Quantitative assessment of tactile allodynia in the rat paw[J].J NeurosciMethods,1994,53(1):55-63.

    [6] Hargreaves K,Dubner R,Brown F,et al.A new and sensitive method for measuring thermal nociception in cutaneous hyperalgesia[J].Pain,1988,32(1):77 -88.

    [7] 孫焱芫,羅 層,李 震,陳 軍.鞘內(nèi)注射孤啡肽對大鼠足底注入蜜蜂毒誘致長時程自發(fā)痛、痛敏和炎癥的不同效果[J].生理學(xué)報,2004,56(3):321-7.

    [7] Sun Y Y,Luo C,Li Z,Chen J.Differential actions of intrathecal nociceptin on persistent spontaneous nociception,hyperalgesia and inflammation produced by subcutaneous bee venom injection in conscious rats[J].Acta Physiol Sin,2004,56(3):321 -7.

    [8] Hwang J H,Yaksh T L.The effect of spinal GABA receptor agonists on tactile allodynia in a surgically-induced neruopathic pain model in the rat[J].Pain,1997,70(1):15 - 22

    [9] Jackson M F,Esplin B,Capek R.Reversal of the activity-dependent suppression of GABA-mediated in hippocampal slices from gamma-vinyl GABA(vigabatrin)-pretreated rats[J].Neurophamacology,2000,39(1):65-74.

    [10] Kang T C,Park S K,Hwang I K,et al.Presynapticγ-aminobutyric acid B receptor-mediated regulation of vesicularγ-aminobutyric acid transporter expression in the gerbil hippocampus[J].Neurosci Lett,2003,346(1-2):49 -52.

    猜你喜歡
    背角鞘內(nèi)神經(jīng)病
    HCN通道對大鼠脊髓背角神經(jīng)元P2X受體功能的調(diào)節(jié)作用
    不同劑量兩性霉素B鞘內(nèi)注射聯(lián)合腦脊液持續(xù)引流置換治療新型隱球菌性腦膜炎的對比
    糖尿病人應(yīng)重視神經(jīng)病變
    獨一味對糖尿病痛大鼠脊髓背角內(nèi)膠質(zhì)細胞激活的影響
    中成藥(2018年12期)2018-12-29 12:25:20
    越測越開心
    鞘內(nèi)連續(xù)注射嗎啡和地塞米松在癌性骨痛中的療效及其機制
    癌癥進展(2016年11期)2016-03-20 13:16:06
    多發(fā)性硬化應(yīng)用β干擾素鞘內(nèi)注射治療的效果分析
    脊髓背角MCP-1-JAK2/STAT3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)參與大鼠2型糖尿病神經(jīng)病理性痛的機制研究
    汽車生活(2015年6期)2015-05-30 04:59:21
    腦脊液置換聯(lián)合鞘內(nèi)給藥治療結(jié)核性腦膜炎的臨床效果
    人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 无人区码免费观看不卡| 免费在线观看亚洲国产| 免费av中文字幕在线| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 飞空精品影院首页| 亚洲中文av在线| 青草久久国产| 淫妇啪啪啪对白视频| 曰老女人黄片| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧美在线一区亚洲| 欧美中文综合在线视频| av免费在线观看网站| 天天影视国产精品| 国产成人精品无人区| aaaaa片日本免费| 精品久久久久久久久久免费视频 | 最新美女视频免费是黄的| 激情在线观看视频在线高清 | 搡老乐熟女国产| 欧美不卡视频在线免费观看 | 午夜亚洲福利在线播放| 亚洲一区高清亚洲精品| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 久久久久久久国产电影| 日韩视频一区二区在线观看| 国产精品亚洲av一区麻豆| 色综合婷婷激情| 中文字幕制服av| 99国产精品免费福利视频| 超色免费av| 正在播放国产对白刺激| 不卡一级毛片| 国产一卡二卡三卡精品| 国产精品二区激情视频| 人妻 亚洲 视频| 午夜精品在线福利| 在线免费观看的www视频| √禁漫天堂资源中文www| 久久九九热精品免费| 超色免费av| 高清黄色对白视频在线免费看| 男女之事视频高清在线观看| 交换朋友夫妻互换小说| 大香蕉久久成人网| aaaaa片日本免费| 伦理电影免费视频| 真人做人爱边吃奶动态| 又黄又爽又免费观看的视频| 午夜两性在线视频| 最新的欧美精品一区二区| 男女免费视频国产| 俄罗斯特黄特色一大片| 色精品久久人妻99蜜桃| 久久久久久久久免费视频了| 成人特级黄色片久久久久久久| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 男人的好看免费观看在线视频 | 美女福利国产在线| 亚洲精品在线观看二区| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 色老头精品视频在线观看| 天天影视国产精品| 高清毛片免费观看视频网站 | 日日夜夜操网爽| 黄色 视频免费看| 国产一区二区三区综合在线观看| 大陆偷拍与自拍| 欧美+亚洲+日韩+国产| 成人国语在线视频| 校园春色视频在线观看| 日韩中文字幕欧美一区二区| 黄色视频不卡| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 女性被躁到高潮视频| 国产成人系列免费观看| 在线观看午夜福利视频| 国精品久久久久久国模美| 精品电影一区二区在线| 免费女性裸体啪啪无遮挡网站| 成年女人毛片免费观看观看9 | 80岁老熟妇乱子伦牲交| 十八禁人妻一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 欧美日韩乱码在线| 老鸭窝网址在线观看| 大码成人一级视频| 50天的宝宝边吃奶边哭怎么回事| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 在线观看免费视频日本深夜| 午夜免费成人在线视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 18禁美女被吸乳视频| 日韩大码丰满熟妇| 国产欧美日韩综合在线一区二区| 夜夜爽天天搞| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 女人精品久久久久毛片| 国产在线精品亚洲第一网站| 色老头精品视频在线观看| 久久人人97超碰香蕉20202| 久久精品aⅴ一区二区三区四区| 视频区欧美日本亚洲| 夜夜爽天天搞| e午夜精品久久久久久久| 我的亚洲天堂| 欧美人与性动交α欧美软件| 黄色女人牲交| 人人妻人人澡人人看| 美国免费a级毛片| 国产xxxxx性猛交| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 黄片播放在线免费| 日本五十路高清| 在线看a的网站| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久| 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 国产欧美亚洲国产| 无人区码免费观看不卡| 成人永久免费在线观看视频| 丰满的人妻完整版| 亚洲人成电影免费在线| 在线十欧美十亚洲十日本专区| 午夜福利一区二区在线看| 亚洲五月婷婷丁香| 欧美乱色亚洲激情| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 嫁个100分男人电影在线观看| 亚洲欧美日韩高清在线视频| 国产一区有黄有色的免费视频| 中亚洲国语对白在线视频| 久久热在线av| 在线视频色国产色| 中国美女看黄片| 看免费av毛片| 国产又色又爽无遮挡免费看| 69精品国产乱码久久久| 成年人午夜在线观看视频| 亚洲成人国产一区在线观看| 亚洲一区高清亚洲精品| 麻豆乱淫一区二区| 久久中文字幕一级| 黄片播放在线免费| 国产xxxxx性猛交| 黄片大片在线免费观看| 国产成人啪精品午夜网站| 9色porny在线观看| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 精品福利观看| 91大片在线观看| 最近最新中文字幕大全免费视频| 国产一区在线观看成人免费| 18禁观看日本| 飞空精品影院首页| av欧美777| 久久中文字幕一级| 久久这里只有精品19| 人妻丰满熟妇av一区二区三区 | 久久国产乱子伦精品免费另类| 亚洲av成人av| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产亚洲欧美精品永久| 国产精品1区2区在线观看. | 国产精华一区二区三区| 亚洲av成人一区二区三| 国产不卡一卡二| 男人的好看免费观看在线视频 | av线在线观看网站| a在线观看视频网站| 亚洲中文日韩欧美视频| 99国产极品粉嫩在线观看| 十八禁网站免费在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 免费看a级黄色片| 午夜福利在线观看吧| 99精品在免费线老司机午夜| 国产在线观看jvid| 无人区码免费观看不卡| 在线观看www视频免费| 久久中文字幕人妻熟女| 精品第一国产精品| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产熟女午夜一区二区三区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看 | videosex国产| 无人区码免费观看不卡| 久热爱精品视频在线9| 天堂动漫精品| 欧美国产精品一级二级三级| 久久精品国产a三级三级三级| 啪啪无遮挡十八禁网站| 热re99久久国产66热| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| 在线观看日韩欧美| 九色亚洲精品在线播放| 免费观看人在逋| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 搡老岳熟女国产| 91国产中文字幕| 免费在线观看视频国产中文字幕亚洲| 大香蕉久久网| 国产精品一区二区在线不卡| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久9热在线精品视频| 岛国在线观看网站| 久久精品人人爽人人爽视色| 黄色a级毛片大全视频| 午夜影院日韩av| 欧美亚洲 丝袜 人妻 在线| 亚洲国产欧美网| 午夜福利一区二区在线看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 又紧又爽又黄一区二区| 国产成人精品久久二区二区91| 看免费av毛片| 欧美午夜高清在线| 99久久综合精品五月天人人| 乱人伦中国视频| 在线观看午夜福利视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 大香蕉久久网| 亚洲在线自拍视频| 两个人免费观看高清视频| 精品一区二区三区四区五区乱码| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美日韩乱码在线| 精品卡一卡二卡四卡免费| 欧美午夜高清在线| 国产激情久久老熟女| ponron亚洲| 国产精品久久视频播放| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产男女内射视频| 久久国产乱子伦精品免费另类| 男人操女人黄网站| 亚洲成人免费电影在线观看| 免费人成视频x8x8入口观看| 一本大道久久a久久精品| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 午夜视频精品福利| 久久午夜亚洲精品久久| 亚洲三区欧美一区| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 免费日韩欧美在线观看| 国内毛片毛片毛片毛片毛片| 色播在线永久视频| 日韩三级视频一区二区三区| 久久影院123| 亚洲欧美色中文字幕在线| 精品熟女少妇八av免费久了| 热re99久久精品国产66热6| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 色播在线永久视频| 99在线人妻在线中文字幕 | 国产xxxxx性猛交| 人人妻人人澡人人看| 国产亚洲精品久久久久久毛片 | 天堂俺去俺来也www色官网| 香蕉丝袜av| 国精品久久久久久国模美| 他把我摸到了高潮在线观看| 欧洲精品卡2卡3卡4卡5卡区| 丁香欧美五月| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 啦啦啦在线免费观看视频4| 亚洲精品久久成人aⅴ小说| av片东京热男人的天堂| 好男人电影高清在线观看| 久久精品亚洲av国产电影网| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 性色av乱码一区二区三区2| 国产成人免费无遮挡视频| 91麻豆精品激情在线观看国产 | 亚洲情色 制服丝袜| 无遮挡黄片免费观看| 中文字幕人妻熟女乱码| 久久婷婷成人综合色麻豆| 中国美女看黄片| 女性被躁到高潮视频| 亚洲性夜色夜夜综合| 99精品在免费线老司机午夜| 一二三四社区在线视频社区8| 十八禁人妻一区二区| 国产成人一区二区三区免费视频网站| 欧美激情高清一区二区三区| 视频在线观看一区二区三区| 精品一区二区三区四区五区乱码| 国产乱人伦免费视频| 精品国产乱码久久久久久男人| 久久国产亚洲av麻豆专区| 欧美黄色片欧美黄色片| 国产人伦9x9x在线观看| 亚洲视频免费观看视频| 黄色丝袜av网址大全| 国产一区在线观看成人免费| 久久久久国产一级毛片高清牌| 丝瓜视频免费看黄片| 制服诱惑二区| 身体一侧抽搐| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产精品亚洲一级av第二区| 丝袜人妻中文字幕| 又紧又爽又黄一区二区| 又大又爽又粗| 在线观看免费视频日本深夜| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片 | 另类亚洲欧美激情| 久久久久精品国产欧美久久久| 搡老岳熟女国产| 久久精品成人免费网站| www日本在线高清视频| 天天添夜夜摸| 91在线观看av| 99精国产麻豆久久婷婷| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 成人免费观看视频高清| 成人精品一区二区免费| 国产成人精品在线电影| 国产1区2区3区精品| 一二三四社区在线视频社区8| xxx96com| 宅男免费午夜| 人人澡人人妻人| 国产一卡二卡三卡精品| 黑人欧美特级aaaaaa片| 日本精品一区二区三区蜜桃| 夜夜躁狠狠躁天天躁| 久久中文看片网| 国产精品久久电影中文字幕 | 久久精品亚洲av国产电影网| 妹子高潮喷水视频| 国产欧美日韩一区二区精品| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 亚洲午夜理论影院| 国产一区二区激情短视频| 精品国产乱子伦一区二区三区| 亚洲第一青青草原| 黄片播放在线免费| 99在线人妻在线中文字幕 | 捣出白浆h1v1| 欧美日韩福利视频一区二区| 天堂√8在线中文| videosex国产| 免费在线观看亚洲国产| 亚洲色图综合在线观看| 久久久精品免费免费高清| av网站在线播放免费| 极品少妇高潮喷水抽搐| 久久久久视频综合| 男女午夜视频在线观看| 中出人妻视频一区二区| 啦啦啦免费观看视频1| 中出人妻视频一区二区| 久久狼人影院| 日韩欧美在线二视频 | 国产97色在线日韩免费| 亚洲欧美色中文字幕在线| 少妇的丰满在线观看| 波多野结衣av一区二区av| 在线av久久热| 日韩精品免费视频一区二区三区| 国产片内射在线| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 丰满迷人的少妇在线观看| 欧美激情 高清一区二区三区| 伦理电影免费视频| 99精品欧美一区二区三区四区| 9色porny在线观看| 亚洲精品粉嫩美女一区| 男男h啪啪无遮挡| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区 | 久久香蕉国产精品| 日日爽夜夜爽网站| 99精国产麻豆久久婷婷| 99国产精品一区二区三区| 在线看a的网站| 下体分泌物呈黄色| 十八禁人妻一区二区| 日本黄色视频三级网站网址 | 91成人精品电影| 欧美黄色淫秽网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 伦理电影免费视频| 十八禁网站免费在线| av国产精品久久久久影院| 久久香蕉国产精品| 精品久久久精品久久久| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放 | 欧美黄色片欧美黄色片| 国精品久久久久久国模美| 久久久久久久午夜电影 | 国产亚洲精品第一综合不卡| 人妻久久中文字幕网| 一a级毛片在线观看| 校园春色视频在线观看| 久久天堂一区二区三区四区| 看免费av毛片| 91成年电影在线观看| 国产亚洲精品一区二区www | 欧美日韩黄片免| 久久亚洲真实| 高潮久久久久久久久久久不卡| 国产精品国产高清国产av | 国产精品99久久99久久久不卡| av天堂在线播放| 天天影视国产精品| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 国产精品一区二区免费欧美| 亚洲中文字幕日韩| 叶爱在线成人免费视频播放| 国产日韩一区二区三区精品不卡| 麻豆成人av在线观看| 另类亚洲欧美激情| 十八禁人妻一区二区| 91在线观看av| 午夜福利欧美成人| 桃红色精品国产亚洲av| 99国产精品99久久久久| 免费看a级黄色片| 国产精品久久视频播放| 国产精品乱码一区二三区的特点 | 免费观看精品视频网站| 国产又色又爽无遮挡免费看| 国产精品秋霞免费鲁丝片| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 少妇被粗大的猛进出69影院| 69精品国产乱码久久久| 一本大道久久a久久精品| 男女午夜视频在线观看| 夜夜夜夜夜久久久久| 久久久久久免费高清国产稀缺| 欧美日韩亚洲综合一区二区三区_| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 极品少妇高潮喷水抽搐| 少妇裸体淫交视频免费看高清 | 国产欧美日韩一区二区三| 女人精品久久久久毛片| 18禁观看日本| 成年人黄色毛片网站| 一二三四在线观看免费中文在| 中文字幕人妻丝袜制服| 色综合婷婷激情| 久久久水蜜桃国产精品网| 欧美精品av麻豆av| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 国产不卡av网站在线观看| 91成人精品电影| 丝袜人妻中文字幕| 美女国产高潮福利片在线看| 国产男女超爽视频在线观看| 国产免费男女视频| 久久精品成人免费网站| 久久久久久久国产电影| 99久久综合精品五月天人人| 久久中文看片网| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 国产91精品成人一区二区三区| 久久青草综合色| 久久中文字幕人妻熟女| 久热爱精品视频在线9| 免费观看a级毛片全部| 男女午夜视频在线观看| 黄色丝袜av网址大全| 亚洲熟妇熟女久久| 高清欧美精品videossex| 午夜福利在线观看吧| 少妇粗大呻吟视频| 成年女人毛片免费观看观看9 | 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 国产不卡av网站在线观看| 中文字幕av电影在线播放| 91av网站免费观看| 午夜两性在线视频| 日韩一卡2卡3卡4卡2021年| 亚洲国产毛片av蜜桃av| 91大片在线观看| 久久久国产精品麻豆| av不卡在线播放| 18在线观看网站| 老熟妇仑乱视频hdxx| 三级毛片av免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 香蕉国产在线看| 午夜福利在线观看吧| 无限看片的www在线观看| 19禁男女啪啪无遮挡网站| 久久人人爽av亚洲精品天堂| 精品国产美女av久久久久小说| 法律面前人人平等表现在哪些方面| 精品国产一区二区三区四区第35| 欧美黄色淫秽网站| tube8黄色片| 十分钟在线观看高清视频www| 国产精品影院久久| 久久久精品国产亚洲av高清涩受| 日韩免费av在线播放| 日韩有码中文字幕| 男人舔女人的私密视频| 欧美色视频一区免费| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 一区在线观看完整版| 国产成人欧美| 久久久国产成人免费| 每晚都被弄得嗷嗷叫到高潮| 一级作爱视频免费观看| 一进一出抽搐gif免费好疼 | 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 一级黄色大片毛片| 久久午夜亚洲精品久久| 嫩草影视91久久| 国产区一区二久久| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲avbb在线观看| 国产三级黄色录像| 国产精品99久久99久久久不卡| 在线观看免费午夜福利视频| av欧美777| 免费一级毛片在线播放高清视频 | 日韩欧美免费精品| 成人特级黄色片久久久久久久| 99热网站在线观看| 精品乱码久久久久久99久播| 一级毛片高清免费大全| 午夜福利在线观看吧| 久久精品国产a三级三级三级| 男女高潮啪啪啪动态图| 久久国产精品大桥未久av| 欧美日韩精品网址| 免费在线观看黄色视频的| 国产真人三级小视频在线观看| 怎么达到女性高潮| 久久99一区二区三区| 国产高清视频在线播放一区| 午夜久久久在线观看| 亚洲精品国产精品久久久不卡| a级毛片黄视频| 日韩有码中文字幕| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 久久精品国产综合久久久| 国产成人影院久久av| 午夜免费成人在线视频| 黑人欧美特级aaaaaa片| 亚洲av第一区精品v没综合| 亚洲国产欧美日韩在线播放| 国产激情久久老熟女| 久久精品人人爽人人爽视色| 在线观看免费视频日本深夜| 在线av久久热| 国产欧美日韩精品亚洲av| a级毛片黄视频| 视频区图区小说| 热99久久久久精品小说推荐| 香蕉久久夜色| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕| 国产真人三级小视频在线观看| 国精品久久久久久国模美| 老鸭窝网址在线观看| 乱人伦中国视频| 久久热在线av| 满18在线观看网站| 纯流量卡能插随身wifi吗| 免费av中文字幕在线| 大陆偷拍与自拍| 妹子高潮喷水视频| 亚洲精品国产一区二区精华液| 国产免费现黄频在线看| 侵犯人妻中文字幕一二三四区| 国产亚洲欧美98| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 欧美不卡视频在线免费观看 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 亚洲五月婷婷丁香| 国产一区在线观看成人免费| 美女福利国产在线| 黄片大片在线免费观看| 美女午夜性视频免费| 一级毛片高清免费大全| 黄片大片在线免费观看| 99re在线观看精品视频| 亚洲中文日韩欧美视频| 青草久久国产| av欧美777| 韩国av一区二区三区四区| 如日韩欧美国产精品一区二区三区| 国产一区在线观看成人免费| 看黄色毛片网站| 久久精品亚洲av国产电影网| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 在线国产一区二区在线| 欧美日韩成人在线一区二区| 国产一区在线观看成人免费| 在线国产一区二区在线| 香蕉国产在线看| 日韩欧美一区视频在线观看| 91九色精品人成在线观看| 欧美日韩视频精品一区| 国产高清激情床上av| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 欧美人与性动交α欧美精品济南到| 在线观看免费视频网站a站| 女人爽到高潮嗷嗷叫在线视频| 国产熟女午夜一区二区三区| 热99久久久久精品小说推荐| 亚洲va日本ⅴa欧美va伊人久久| 一进一出抽搐动态| 欧美黄色片欧美黄色片| 9热在线视频观看99| 久久久久久亚洲精品国产蜜桃av|