熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較

李小穎，高 凱，董 偉，張連峰，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國家中醫(yī)藥局人類疾病動(dòng)物模型3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

熒光素酶標(biāo)的人肝癌細(xì)胞裸鼠異種移植瘤模型的生物發(fā)光成像和PET-CT成像比較

李小穎1，高 凱1，董 偉1，張連峰1，2

(1.中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021;2.國家中醫(yī)藥局人類疾病動(dòng)物模型3級(jí)實(shí)驗(yàn)室，北京 100021)

目的 利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞株BEL-7402建立裸鼠肝原位移植模型，及小鼠肝原位移植模型的生物發(fā)光和小動(dòng)物PET-CT成像的比較。方法 構(gòu)建表達(dá)熒光素酶基因的真核表達(dá)載體并將其轉(zhuǎn)入人肝癌細(xì)胞BEL-7402，經(jīng)梯度濃度G418篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng)。BALB/cA-nu裸鼠肝門靜脈接種5×105個(gè)發(fā)光細(xì)胞使其成瘤，活體熒光成像和小動(dòng)物PET-CT成像系統(tǒng)觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況。結(jié)果 獲得了穩(wěn)定表達(dá)Luc的人肝癌細(xì)胞株，將其接種到裸鼠體內(nèi)，活體熒光成像系統(tǒng)觀察發(fā)現(xiàn)能夠成瘤，小動(dòng)物PET-CT影像觀察發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟邊緣對(duì)18F-FDG有高攝取區(qū)域。結(jié)論 利用熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動(dòng)物活體成像結(jié)合小動(dòng)物PET-CT技術(shù)為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，為進(jìn)一步研究肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)提供了新的有用工具。

人肝癌細(xì)胞;腫瘤模型;熒光素酶;生物發(fā)光成像;小動(dòng)物PET-CT

人肝癌BEL-7402細(xì)胞株是1974年從臨床肝癌手術(shù)標(biāo)本中建立的，細(xì)胞群體倍增時(shí)間為20 h，細(xì)胞形態(tài)呈上皮樣細(xì)胞，在電子顯微鏡下亦顯示上皮細(xì)胞所具有的橋粒和張力原纖維，與臨床肝癌細(xì)胞相似，分瓶培養(yǎng)第4天時(shí)，其有絲分裂指數(shù)約為7%。BEL-7402細(xì)胞的染色體數(shù)為不足三倍體，有一個(gè)異常的近端著絲點(diǎn)染色體，間接免疫熒光法測(cè) BEL-7402細(xì)胞內(nèi)的 AFP為陽性反應(yīng)，LDH同工酶譜顯示與成年人肝細(xì)胞不同，而與人胚肝及臨床肝癌相近。目前國內(nèi)外學(xué)者主要集中于不同抗腫瘤藥物體外抗腫瘤作用和機(jī)制的研究［1～5］。

本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記人肝癌細(xì)胞BEL-7402，并建立表達(dá)熒光素酶的原位肝癌裸鼠模型，利用生物發(fā)光成像技術(shù)對(duì)此模型內(nèi)的腫瘤生長(zhǎng)進(jìn)行非侵入性的連續(xù)監(jiān)測(cè)。同時(shí)評(píng)價(jià)了生物發(fā)光成像和小動(dòng)物PET-CT成像在裸小鼠肝原位移植模型建立中的作用，為肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究和藥物開發(fā)提供了新的有用工具。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 試劑與儀器：人肝癌細(xì)胞BEL-7402凍存于本實(shí)驗(yàn)室，L-谷氨酰胺(GIBCO公司)、雙抗(GIBCO公司)、DMEM(GIBCO公司)、胎牛血清(GIBCO公司)、G418(AMRESCO 公司)、脂質(zhì)體 2000(Invitrogene公司)?；铙w熒光影像系統(tǒng)(I.C.E.，日本Roper公司)、倒置顯微鏡(Nikon TS100)。18FFDG由中國原子能科學(xué)研究院提供。PET成像系統(tǒng)為德國西門子INVEON PET/CT影像系統(tǒng)。PET系統(tǒng)采用64塊LSO(硅酸镥)晶體，PET軸向視野為(FOV)12.7 cm，軸向分辨率距中心1 cm處小于1.7 mm。時(shí)間分辨率小于1.5 ns。CT球管電壓為80 kV，球管電流為 400 μA，曝光時(shí)間為 300 ms，，CT校描時(shí)間約8 min，PET發(fā)射掃描10 min，PET重建時(shí)使用CT數(shù)據(jù)進(jìn)行衰減校正。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：BALB/cA-nu裸小鼠購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司［SCXK(京)2007-0001］，鼠齡5周，體重15～18 g，在本實(shí)驗(yàn)室無特定病原體(specific-pathogen free，SPF)的飼養(yǎng)間飼養(yǎng)。所有實(shí)驗(yàn)操作程序均經(jīng)過實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用管理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)為GC-09-2001)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：用含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素，100 μg/mL鏈霉素的 DMEM培養(yǎng)基作為BEL-7402細(xì)胞的培養(yǎng)液，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建帶有篩選標(biāo)記的載體：pCAGGS-Neo-Luc由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，用 PCR的方法從質(zhì)粒pcDNA3.1(+)中擴(kuò)增neo基因片段，同時(shí)在兩端引入酶切位點(diǎn) XhoⅠ;從質(zhì)粒 pGL3中用 EcoRⅠ和XbaⅠ切取Luc基因片段，之后分別將neo基因片段和Luc基因片段重組進(jìn)含有chicken β-actin啟動(dòng)子的載體pCAGGS中。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和篩選：采用脂質(zhì)體2 000轉(zhuǎn)染BEL-7402細(xì)胞(具體轉(zhuǎn)染步驟參照脂質(zhì)體2 000操作說明)。轉(zhuǎn)染后24 h，用含 1 000 μg/mL G418的培養(yǎng)液篩選細(xì)胞，直至形成肉眼可見的單克隆，挑取單克隆于96孔板，于5%CO2，37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，匯合度達(dá)70% ～90%后，傳代(1∶2傳代)，取其中一塊96孔板加入適量底物luciferin后進(jìn)行生物發(fā)光檢測(cè)，選擇其中高表達(dá)的克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.2.4 裸鼠肝癌原位移植模型的建立和活體熒光觀察：收集處于生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，稀釋至2×106cells/mL。取250 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行肝門靜脈接種，共接種3只。每隔一周觀察一次，連續(xù)觀察四周，觀察前每只裸鼠腹腔注射熒光素底物(1.5 mg/10 g)，飽和三溴乙醇(0.18 mL/10 g)麻醉后放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析。

1.2.5 小動(dòng)物PET-CT影像學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)前6 h禁食禁水。將小鼠放入吸氣室內(nèi)通過吸入混有2%異氟烷的純氧實(shí)施麻醉。麻醉完全后，通過尾靜脈彈丸式注射約7.4 MBq(200 μCi)的放射性示蹤劑18FFDG。然后將小鼠俯臥位固定于掃描床，使小鼠頭部長(zhǎng)軸和掃描器長(zhǎng)軸平行且位于掃描器視野內(nèi)。18F-FDG攝取45 min后進(jìn)行10 min PET圖像采集。PET采集完成床板移至CT機(jī)架視野中心，進(jìn)行約8 min的采集。在此過程中通過面罩持續(xù)吸入在1 L/min的純氧環(huán)境2%異氟烷維持麻醉狀態(tài)。

1.2.6 腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)觀察：腫瘤生長(zhǎng)4周后，斷頸處死小鼠并解剖，暴露肝臟，取腫瘤部位制成石蠟切片并進(jìn)行H-E染色。

2 結(jié)果

2.1 穩(wěn)定高表達(dá)Luc的單克隆細(xì)胞株

利用chicken β-actin系統(tǒng)表達(dá)性強(qiáng)啟動(dòng)子建立了帶有篩選標(biāo)記的表達(dá)載體pCAGGS-Neo-Luc(圖1A)，將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，形成的單克隆進(jìn)行成像，成像前10 min，在96孔板內(nèi)加入用 DMEM配置的底物luciferin(1 mg/mL)20 μL，放入活體熒光影像系統(tǒng)攝像15 min，Slide Book 4.0軟件進(jìn)行分析(圖1B)。如圖2箭頭所示，選取高表達(dá)Luc的克隆株擴(kuò)大培養(yǎng)并接種裸鼠。

2.2 Luc標(biāo)記 BEL-7402小鼠肝癌原位腫瘤模型的動(dòng)態(tài)觀察和小動(dòng)物PET-CT影像學(xué)觀察

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Luc標(biāo)記BEL-7402腫瘤細(xì)胞懸液經(jīng)肝門靜脈接種于3只 BALB/cA-nu小鼠，細(xì)胞密度5×105cells/只。分別在接種的 7、14、21和28 d觀察腫瘤的生長(zhǎng)情況(封2圖2A～D)。在接種的第7天，就可以觀察到腫瘤發(fā)光，第14天時(shí)腫瘤的發(fā)光強(qiáng)度較第7天時(shí)變?nèi)?，推測(cè)細(xì)胞懸液在第14天時(shí)才成瘤。14 d后，隨著觀察天數(shù)的增加，腫瘤的體積和發(fā)光強(qiáng)度增強(qiáng)，且具有很好的線性關(guān)系。

腫瘤接種28 d后，經(jīng)小鼠尾靜脈注入18F-FDG后行 MicroPET-CT顯像，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟邊緣有約0.3 cm×1.6 cm帶狀高攝取區(qū)域(封2圖2E)。

2.3 腫瘤組織的病理形態(tài)學(xué)觀察

腫瘤生長(zhǎng)4周后，斷頸處死小鼠并解剖，暴露肝臟，發(fā)現(xiàn)肝臟上有灰白色的腫瘤組織，表面呈結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地較硬，獨(dú)立或彌漫分布在肝表面和肝邊緣處，部分結(jié)節(jié)可融合成較大的結(jié)節(jié)(彩插1圖3A)。

H-E染色肝臟內(nèi)見多個(gè)大小不等腫瘤病灶，腫瘤邊界較清楚，瘤細(xì)胞呈巢狀分布，有纖細(xì)的纖維組織分隔，腫瘤細(xì)胞大小較一致，胞質(zhì)紅染，核圓形或橢圓形，染色深，核分裂多見(彩插1圖3B)。

3 討論

目前在模型動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行活體成像主要依賴于熒光與生物發(fā)光兩種技術(shù)。熒光發(fā)光需要激發(fā)光使得熒光基團(tuán)達(dá)到較高的能量水平，然后發(fā)射出較長(zhǎng)波長(zhǎng)的發(fā)射光，但是生物體內(nèi)很多物質(zhì)在受到激發(fā)光激發(fā)后，也會(huì)發(fā)出熒光，產(chǎn)生的非特異性熒光會(huì)影響到檢測(cè)靈敏度。特別是當(dāng)發(fā)光細(xì)胞深藏于組織內(nèi)部，則需要較高能量的激發(fā)光源，也就會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的背景噪音。生物發(fā)光成像相對(duì)于熒光成像，其靈敏度高。作為體內(nèi)報(bào)告源，生物發(fā)光較之熒光的優(yōu)點(diǎn)之一為不需要激發(fā)光的激發(fā)，它是以酶和底物的特異作用而發(fā)光，且動(dòng)物體自身不會(huì)發(fā)光，這樣生物發(fā)光具有極低的背景。雖然熒光信號(hào)遠(yuǎn)遠(yuǎn)強(qiáng)于生物發(fā)光，但極低的自發(fā)光水平使得生物發(fā)光的信噪比遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于熒光。生物發(fā)光成像技術(shù)可以觀測(cè)活體模型動(dòng)物體內(nèi)腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及對(duì)藥物的反應(yīng)［6～8］，是研究腫瘤發(fā)展及抗腫瘤藥物篩選和評(píng)價(jià)的新興手段。

正電子發(fā)射斷層顯像技術(shù)(positron emission tomography，PET)，是利用正電子核素標(biāo)記的示蹤劑進(jìn)行活體顯像，能夠無創(chuàng)傷地、動(dòng)態(tài)地、定量地從分子水平觀察活體生理生化變化特點(diǎn)的一種定量顯像技術(shù)。是目前最成熟的分子影像技術(shù)。小動(dòng)物PET是基于PET臨床診斷技術(shù)發(fā)展起來的專門用于小動(dòng)物的斷層顯像裝置，它具有靈敏度高，可定量以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果可直接類推至臨床等優(yōu)點(diǎn)，因而受到了廣大研究者的重視。最新的技術(shù)將PET與CT結(jié)合起來成為 PET-CT，PET-CT是將PET提供的組織細(xì)胞代謝顯像及在受體大分子、蛋白質(zhì)、核酸基礎(chǔ)上進(jìn)行的分子影像和CT提供的反映組織解剖結(jié)構(gòu)、血流灌注的顯像有機(jī)地結(jié)合在一起的最新的影像設(shè)備。PET-CT實(shí)現(xiàn)了從單一的形態(tài)學(xué)診斷進(jìn)到功能與形態(tài)相結(jié)合的多角度的綜合影像診斷的飛躍，形成一種全新的影像學(xué)，解剖-功能影像學(xué)。

18F-氟代脫氧葡萄糖(18F-nuorodeoxyglucose，18F-FDG)是目前臨床上應(yīng)用最多的腫瘤代謝顯像劑。絕大多數(shù)惡性腫瘤細(xì)胞具有高代謝特點(diǎn)，葡萄糖為組織細(xì)胞能量的主要來源之一，惡性腫瘤細(xì)胞的異常增殖需要葡萄糖的過度利用，其途徑是增加葡萄糖膜轉(zhuǎn)運(yùn)能力和糖代謝通路中的主要調(diào)控酶活性。惡性腫瘤細(xì)胞中的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)信息核糖核酸(mRNA)表達(dá)增高，導(dǎo)致葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白增加。因此，腫瘤細(xì)胞內(nèi)可積聚大量18F-FDG，經(jīng)PET顯像可顯示腫瘤的部位、形態(tài)、大小、數(shù)量及腫瘤內(nèi)的放射性分布。

本實(shí)驗(yàn)利用螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記人肝癌細(xì)胞BEL-7402，獲得穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的細(xì)胞克隆，經(jīng)過多次傳代表達(dá)水平穩(wěn)定，標(biāo)記細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)方式、生長(zhǎng)速度及致瘤能力等與未轉(zhuǎn)染細(xì)胞無明顯差異，可以反映 BEL-7402腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的標(biāo)記細(xì)胞，其他標(biāo)記細(xì)胞的研究報(bào)道也證實(shí)了類似的結(jié)果［9］。將其經(jīng)肝門靜脈接種裸鼠，用活體熒光成像系統(tǒng)連續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)能夠成瘤，并且腫瘤的體積與發(fā)光強(qiáng)度有相關(guān)性。同時(shí)對(duì)此模型進(jìn)行小動(dòng)物PET-CT影像學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)小鼠肝臟邊緣對(duì)18F-FDG有約0.3 cm×1.6 cm帶狀高攝取區(qū)域。另外解剖學(xué)觀察及肝臟組織病理形態(tài)學(xué)分析，進(jìn)一步驗(yàn)證了該方法的可行性。小動(dòng)物活體成像和小動(dòng)物PET-CT成像技術(shù)對(duì)腫瘤動(dòng)物模型微小病灶的檢測(cè)靈敏度極高，能夠進(jìn)行無創(chuàng)、實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)的動(dòng)物活體觀察，從而對(duì)同一實(shí)驗(yàn)對(duì)象進(jìn)行不同時(shí)間點(diǎn)的觀察，減少實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體間差異，與傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)方法相比，可以大大減少動(dòng)物的用量，符合替代、減少、優(yōu)化的“3R”原則，已成為廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)及藥物開發(fā)等研究領(lǐng)域。小動(dòng)物活體成像具有比小動(dòng)物PET-CT成像技術(shù)操作簡(jiǎn)單，靈敏度高，特異性好，無放射性，價(jià)錢便宜等優(yōu)點(diǎn)。但是小動(dòng)物活體成像只觀察腫瘤細(xì)胞的多少與體積變化，不能實(shí)現(xiàn)對(duì)精確定位的要求，只要細(xì)胞活著就可以觀察到，而不考慮細(xì)胞的生存狀態(tài)和代謝能力以及活躍程度。小動(dòng)物PET分辨率較小動(dòng)物活體成像明顯提高，實(shí)現(xiàn)了在活體上非侵入性分子水平顯像，結(jié)合小動(dòng)物CT實(shí)現(xiàn)了圖像融合，達(dá)到了對(duì)精確定位的要求［10，11］。然而18F-FDG是非特異性腫瘤顯像劑，除腫瘤外，正常組織可生理性攝取，一些良性病變也可攝取，容易出現(xiàn)假陽性和假陰性顯像［12，13］，另外有放射性，價(jià)錢昂貴。

綜上，利用螢火蟲熒光素酶基因標(biāo)記的人肝癌細(xì)胞 BEL-7402成功建立了原位肝癌裸鼠模型，小動(dòng)物活體成像結(jié)合小動(dòng)物PET-CT技術(shù)為原位腫瘤模型的建立提供了一種新的可靠的技術(shù)，為進(jìn)一步研究肝癌生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移機(jī)制和藥物開發(fā)提供了新的有用工具。

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Comparison between Bioluminescent Imaging and Small-animal PET-CT in Xenotransplantation Tumor Model with Luc-expressing Cell

LI Xiao-ying1，GAO Kai1，DONG Wei1，ZHANG Lian-feng1，2
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Heath，Institute of Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences ＆ Comparative Medical Center，Peking Union Medical College，Beijing 100021，China;2.Key Laboratory of Human Diseases Animal Model State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China)

Objective To establish hepatic carcinoma mouse model with human BEL-7402 cells expressing luciferase and to compare bioluminescence imaging with that by small-animal PET-CT.Method The vector containing luciferase gene was constructed and transfected into human BEL-7402 liver tumor cell line and selected with G418 to obtain stable Luc-expressing clones.5×105cells，constitutively expressing luciferase，were inoculated to liver of BALB/cA-nu through hepatic portal vein for assessment of tumor growth with the whole-body optical imaging system and small-animal PET-CT.Result The stable Luc-expressing BEL-7402 cell lines were abtained，which could grow to tumor mass after implantation.There was high uptake of18F-FDG at the edge of liver with small-animal PET-CT.Conclusion Luc-labeled BEL-7402 cell lines and a mouse tumor model based on the cell lines are established，the whole-body optical imaging system combined with small-animal PET-CT provides a new and reliable technology for the in situ tumor model，which is a new tool to further study the mechanism of metastasis and drug discovery.

Human hepatic carcinoma;Tumor model;Luciferase;Bioluminescent imaging;Small-animal PET-CT

R541 R332

A

1671-7856(2011)03-0010-04

2010-06-21

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.03.003

衛(wèi)生部項(xiàng)目，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和人類疾病動(dòng)物模型資源擴(kuò)展(200802036)和十一五新藥專項(xiàng)支持(2008ZX09305-001)。

李小穎(1981-)，女，實(shí)習(xí)研究員。E-mail：lixiaoyinghebei@163.com。

張連峰，E-mail：zhanglf@cnilas.org。