重組人血白蛋白的研究進展

溫中華 朱 海 戴小宇 張曉冬*

（1 第二軍醫(yī)大學生物技術系，上海 200433；2 第二軍醫(yī)大學藥物安全性評價中心，上海 200433）

人血白蛋白（Human serum albumin，HSA）是人體血漿中含量最豐富的蛋白質(zhì)，約占到血漿蛋白總量的60%。HSA能維持血液動力學平衡和血管內(nèi)滲透壓，吸收組織中多余液體到血液循環(huán)中，使動脈壓升高，廣泛應用于失血創(chuàng)傷燒傷引起的休克，腦水腫及損傷引起的顱壓升高，肝硬化及腎病引起的水腫或腹水，低蛋白血癥的防治和新生兒高膽紅素血癥等。目前臨床使用的HSA制品絕大部分部是從人源血漿中提取純化而得（Plasma-derived HSA，pdHSA），來源有限，價格昂貴，還不能排除病毒（特別是艾滋病病毒和乙肝病毒）或其他潛在致病因子的影響，這都極大限制著HSA的廣泛應用。而重組人血白蛋白（Recombinant human serum albumin，rHSA）則可以避免病毒感染，到目前為止，已在大腸桿菌、枯草桿菌、酵母、植物和轉(zhuǎn)基因動物等系統(tǒng)中進行了rHSA的表達研究，通過基因改造或化學修飾還能進一步擴大rHSA的臨床應用范圍，是目前研究的熱點。

1 rHSA與pdHSA的比較

1.1 結(jié)構(gòu)比較

高度純化的rHSA與pdHSA在分子結(jié)構(gòu)上完全一致，是一條66.5-kDa單鏈、非糖基化多肽鏈，由585個氨基酸殘基組成，富含組氨酸和色氨酸，含17對二硫鍵和一個半胱氨酸位點。rHSA的三級結(jié)構(gòu)呈心形，67%為α-螺旋，不含β-折疊，由三個結(jié)構(gòu)域（（I、Ⅱ和Ⅲ）組成，每個結(jié)構(gòu)域又各包含兩個亞結(jié)構(gòu)域。Sadaharu等[1]分析了rHSA的三個結(jié)構(gòu)域與藥物的結(jié)合能力，發(fā)現(xiàn)I型區(qū)域與藥物結(jié)合的能力最強，這是由其34位上游離的半胱氨酸殘基所決定的。

1.2 功能比較

rHSA作為pdHSA可能的臨床替代品，具有與pdHSA相似的生理功能。大鼠體內(nèi)靜脈注射用同位素125I標記rHSA與pdHSA，發(fā)現(xiàn)二者在組織分布、血液半衰期以及尿液和糞便代謝方面都無顯著差異[2]。一、二、三期臨床試驗結(jié)果表明rHSA具有較好的療效，不良反應較小[3]。在結(jié)合和轉(zhuǎn)運內(nèi)外源性物質(zhì)方面，rHSA對藥物如華法林、苯丙香豆素、普拉洛芬、布洛芬等的立體選擇性結(jié)合特性與pdHSA一致[2]。需要注意的是，HSA在用于治療出血性休克、燒傷、白蛋白過少等病癥時，由于在病理條件下毛細血管對HSA的通透性增加，大量輸入HSA后可能會透過毛細血管壁而導致器官水腫，肺臟對此尤為敏感，從而使病情加重。通過基因工程手段獲得的rHSA二聚體在保留相應的生理功能不變的情況下，既延長了其血漿半衰期，又降低了其毛細血管通過率，將有可能解決這一問題[4]。

1.3 安全性比較

pdHSA由于其可能含有血源捐贈者自身所攜帶的病毒（如艾滋病病毒、肝炎病毒等）和其他潛在的致病因子，使得患者在使用pdHSA制品時將面臨巨大風險。而影響rHSA安全應用于臨床的主要潛在危險因素是其所含有的極少量酵母成分，包括蛋白質(zhì)和甘露聚糖等多糖成分，這些成分可能會在重復注輸時導致急性免疫反應，從而危害患者健康。因此，提高rHSA的分離純化技術，盡可能減少雜質(zhì)含量，將有助于提高rHSA的安全性。

2 rHSA的臨床研究現(xiàn)狀

臨床前研究結(jié)果顯示在分子結(jié)構(gòu)、理化性質(zhì)以及免疫學等方面rHSA與pdHSA相似，針對rHSA安全性和療效的一、二、三期臨床試驗也已在世界許多實驗室和臨床中心相繼開展。

一期臨床實驗主要是對rHSA進行初步的臨床藥理學及人體安全性評價。在日本進行的一期臨床實驗中，25名健康志愿者連續(xù)三天靜脈注射rHSA后，檢測的生理指標（如血壓、脈搏、體質(zhì)量、心電圖檢測、血液和尿液分析等）未發(fā)現(xiàn)藥物相關明顯異常，并且在3個月內(nèi)rHSA抗體滴度無顯著升高[3]。英國DELTA公司一期臨床試驗將rHSA與pdHSA在安全性、耐受性、藥理學以及藥代動力學等方面做了對比，結(jié)果表明二者在這些方面具有相似性[5]。

二期臨床試驗進一步驗證rHSA的有效性和安全性，考察其不良反應。對出血性休克、肝硬化和肝腹水患者的治療結(jié)果證實rHSA具有極好的療效，且不良反應極小[3]。Kazushi[6]等還研究了rHSA在治療患腎病綜合癥的兒童患者中的效果，6名腎病綜合癥兒童患者在接受連有髓袢利尿劑的rHSA（0.3～0.5 g/kg）的治療后，沒有產(chǎn)生嚴重的不良反應。

在擴大的多中心臨床試驗中，423名肝硬化患者經(jīng)過間隔2周的三個周期重復給予rHSA，每個周期持續(xù)3d。結(jié)果顯示血清蛋白水平和膠體滲透壓均顯著升高。423名患者中有96名出現(xiàn)不良反應（22.7%），但均沒有嚴重的過敏反應，而且三個周期之間的不良反應發(fā)生率沒有明顯不同[7]。在其他三期臨床試驗中，rHSA在治療如燒傷、腎病綜合癥、出血性休克、急性腹部不適以及直接心臟外科手術中的高危患者等，也都表現(xiàn)出較好的療效。

3 rHSA的研究趨勢

3.1 融合蛋白

許多蛋白類或多肽藥物在血液中清除速率較快，臨床上不得不提高劑量或用藥次數(shù)，以穩(wěn)定療效，在一定程度上增加了藥物的不良反應以及患者的醫(yī)藥負擔。通過基因重組，將藥物蛋白或多肽的基因與人血白蛋白的基因融合表達，獲得的融合蛋白不僅可以保留原藥物蛋白生物活性，還提高了穩(wěn)定性，延長其半衰期，并有可能增強其靶向性，提高療效。

粒細胞集落刺激因子（G-CSF）是一種分泌型糖蛋白，能有效促進粒細胞、巨噬細胞的分化增生。通過細菌表達的重組粒細胞集落刺激因子（rG-CSF）已經(jīng)應用于臨床，如用于治療患腫瘤放療、化療引起的粒細胞減少癥、再生障礙性貧血等。但由于其半衰期短，為維持最佳療效需要頻繁給藥。通過基因重組，可將rG-CSF的N-末端與rHSA的C-末端連接形成融合蛋白。Halpern等[8]研究了重組人粒細胞集落刺激因子白蛋白融合蛋白在小鼠和食蟹猴體內(nèi)的藥效學和藥動學特點。兩種動物上融合蛋白與非融合型比較半衰期、平均滯留時間和清除率均顯著延長。

Osborn等[9]將人白細胞介素-2（IL-2）基因與HSA基因融合，表達獲得融合蛋白Albuleukin。Albuleukin將IL-2的血漿半衰期從19-57min延長到了6-8h，其在促進淋巴細胞增殖、受體結(jié)合、和誘導NK細胞分泌IFN-γ等方面表現(xiàn)出與rIL-2相似的特點。二者都能有效抑制小鼠腎細胞腺瘤和肝黑色素瘤，并且Albuleukin在預防轉(zhuǎn)移和改善生存率上比rIL-2更有效。其他的研究還有胸腺素-α1（Tα1）和四苯基卟啉等，融合蛋白均顯示出與原來相似的藥效學特性[10,11]。

3.2 藥物載體

rHSA另外一個重要醫(yī)學用途是作為一種新型藥物載體，能有效提高藥物輸送的靶向性和代謝半衰期，這對于不良反應大、機體容易產(chǎn)生耐藥性的藥物來說是一個新的選擇。rHSA作為藥物載體有兩種途徑，其一是形成類似脂質(zhì)體的微囊，包裹著藥物運送到體內(nèi)；另一途徑則是通過化學修飾等方法直接與相應藥物連接進行運輸。

白蛋白微囊按其直徑大小不同經(jīng)靜脈注射入體內(nèi)后可有效輸送到肺部或肝臟。15～30 um或更大直徑的微球體可在流經(jīng)心臟后99%沉積于肺部的毛細血管床；而1～3um大小的微球體則可以通過網(wǎng)狀內(nèi)皮組織90%沉積在肝臟。因此白蛋白微球體可用作藥物載體進行靶向輸送，以減少用藥劑量，減輕不良反應[3]。

rHSA通過化學修飾或基因改造后，還可獲得與特定細胞表面受體相結(jié)合的配體基團，從而進行體內(nèi)靶向輸送。糖蛋白很容易識別相應細胞受體，經(jīng)甘露糖修飾后的人血清白蛋白能有效識別肝臟Kupffer細胞表面甘露糖受體。Kenshiro等[12]成功設計并通過基因工程手段表達出甘露糖化重組人血清白蛋白的三聚體（TM-rHSA），TM-rHSA能識別肝臟非實質(zhì)細胞上的甘露糖受體，從而被選擇性的運送到肝臟。Masaaki等[13]在室溫下通過二硫鍵的斷裂使rHSA部分變性進而連接成水凝膠體，并對水凝膠與苯甲酸鈉、水楊酸和華法林等藥物的結(jié)合和釋放能力進行了實驗，發(fā)現(xiàn)水凝膠化后的rHSA仍保留有對藥物的結(jié)合能力。其將苯甲酸鈉和水楊酸完全釋放需要2h，而華法林則持續(xù)約24h。這表明rHSA水凝膠具有持續(xù)穩(wěn)定釋放藥物的能力，可作為一種新型藥物控釋載體。

將抗腫瘤化療藥物與血蛋白相結(jié)合是目前研究的熱點，紫杉醇白蛋白納米混懸液于2008年6月在我國批準上市，臨床上已得到了廣泛的應用。Naohisa等[14]研究發(fā)現(xiàn)，對于將LY-80移植到大鼠右肢形成的腫瘤，直接進行腫瘤注射硫基一氧化氮-重組人血白蛋白（S-nitrosylated human serum albumin，SNO-HSA），腫瘤生長受到明顯抑制。

用rHSA輸送藥物的一個重要好處是能有效提高機體對相應藥物的耐受性，即便是對于機體已經(jīng)產(chǎn)生耐受的藥物，將其與rHSA聯(lián)合后在再次輸入體內(nèi)時，仍然可能具有一定療效。例如在臨床上有些腎病綜合癥患者由于對利尿劑產(chǎn)生耐受而進一步發(fā)展成嚴重水腫、胸腔積液和腹水時，對其注射已結(jié)合了髓袢利尿劑的rHSA將會產(chǎn)生較好的療效[15]。

4 展 望

應用現(xiàn)代基因工程技術獲得高純度的rHSA在結(jié)構(gòu)、功能和免疫學性質(zhì)等方面pdHSA基本相似，有望成為pdHSA替代產(chǎn)品，日本田ā三菱制藥株式會社研制的基因重組人血白蛋白于2008年全球首次上市，用于治療由于燒傷、肝硬化等引起的白蛋白嚴重丟失等癥。但由于其在臨床中使用劑量大，極其微量的百分比不純物質(zhì)，在單一劑量中就是微克甚至毫克級的，所以要求的純度要更高，因此對rHSA的研究提出了更高的要求，在安全性、功能，以及患者對其認知接受程度上還有許多工作要做。而通過基因工程手段獲得rHSA與其他重要蛋白的融合蛋白，或經(jīng)化學修飾與藥物結(jié)合，使之成為重要的藥物運送載體也是其未來發(fā)展的重要方面。

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