2011年5—6月德國產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌O104:H4暴發(fā)情況初探

高 崧 ，焦新安 ，劉秀梵 ，肖 肖

（1.揚州大學農(nóng)業(yè)部畜禽傳染病學重點開放實驗室，江蘇揚州 225009；2.中國動物衛(wèi)生與流行病學中心，山東青島 266032）

2011年5月以來，德國首先暴發(fā)了產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC）O141:H4引起的人類疾病，并波及歐洲、北美等16個國家，發(fā)病總人數(shù)超過4 000人，死亡50人。本次暴發(fā)的STEC O104:H4是腸聚集性大腸桿菌（Entero-aggregative Escherichia coli，EAggEC） 和腸溶血性大腸桿菌（Entrohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）的重組體。EAggEC常引起人的散發(fā)性或流行性腹瀉，能以特殊方式吸附于上皮細胞Hep-2，這種吸附方式稱為“聚集性”或“疊磚式”吸附[1]。能產(chǎn)生志賀毒素的大腸桿菌均稱為STEC，志賀毒素由前噬菌體（prophage）編碼，該毒素在易感的真核細胞內能抑制蛋白質合成。EHEC是STEC的一個亞類，它除產(chǎn)生志賀毒素外，還能產(chǎn)生由腸上皮細胞消除位點（locus of enterocyte effacement，LEE）編碼的特殊蛋白分泌系統(tǒng)（稱為Ⅲ型分泌系統(tǒng)），該系統(tǒng)能使EHEC吸附于宿主的小腸上皮[2]。本次STEC O104:H4流行是迄今德國歷史上EHEC最大規(guī)模的暴發(fā)，同時，也是世界范圍內HUS最大規(guī)模的暴發(fā)，引起了全世界的關注。根據(jù)已有文獻，本文對即將結束的STEC O104:H4暴發(fā)流行情況作一初步綜述。

1 發(fā)病與流行情況

1.1 整體情況

溶血性尿毒綜合癥（hemolytic-uremic syndrome，HUS）上世紀首先報道于兒童[3]，以急性腎衰、溶血性貧血和血小板減少三者組合為特征。EHEC O157：H7是兒童HUS發(fā)生的主要原因[4]。德國對EHEC引起的胃腸炎（無HUS）病例的定義是：除實驗室確診外，還需具備下列三種癥狀之一，腹瀉（24小時內3次以上拉?。?、腹部絞痛或嘔吐[5]。針對本次STEC O104:H4引起的HUS及腹瀉病例，歐盟專門進行了定義，分為可能病例、疑似病例，和確診病例[6]。

1.1.1 可能病例（possible epidemic case）

任何于2011年5月1日及其以后發(fā)生的病例，其中STEC腹瀉病例滿足腹瀉或血性腹瀉急性發(fā)作，并至少滿足下列實驗室標準之一：（1）分離出產(chǎn)志賀毒素 2（Stx2）或攜帶 stx2基因的大腸桿菌；（2）沒有分離細菌，但從患者糞樣中直接檢測出stx2基因的核酸。

STEC HUS病例則應滿足急性腎衰，并至少下列臨床標準之一：（1）微血管病性溶血性貧血；（2）血小板減少。

1.1.2 疑似病例（probable epidemic case）

指滿足上述STEC腹瀉或STEC HUS可能病例標準，且發(fā)病前存在14天的暴露期（exposure period），并至少滿足下列流行病學標準之一的病例：（1）逗留在德國或任何其他具有已被感染的確診病例存在的國家；（2）消費過來自德國的食物；與確診病例密切接觸過（如同一家庭成員）。

1.1.3 確診病例（confirmed epidemic case）

指滿足可能病例標準，并分離出O104:H4 STEC的病例；或病例滿足疑似病例中規(guī)定的流行病學標準，并且分離出O104血清型STEC。

根據(jù)世界衛(wèi)生組織（WHO）的統(tǒng)計，到2011年7月21日，歐洲、北美共16個國家的4075人發(fā)病（見表1），其中，HUS病例 908例，EHEC（腹瀉）病例 3 167例。另外HUS死亡34例，EHEC（腹瀉）死亡16例[9]。

1.2 流行特點

由于本病首先暴發(fā)于德國，且病例數(shù)德國也最多，來自德國的流行病學資料具有代表性。

Frank等對截止2011年6月18日德國報告的3 222個暴發(fā)病例（包括39個死亡病例）進行了分析，本次暴發(fā)流行具有以下特點[5]。

1.2.1 地區(qū)相對集中

盡管德國16個州均有病例報告，但發(fā)病率最高者在德國北部地區(qū)，分別為漢堡州（Hamburg），10萬人中10.1個病例；石勒蘇益格-荷爾斯泰因州（Schleswig-Holstein），10萬人中6.7個病例；不萊梅州（Bremen），10萬人中2.7個病例；梅克倫堡-前波美拉尼亞州（Mecklenburg-Vorpommern）；10萬人中2.2個病例；下薩克森州（Lower Saxony）；10萬人中1.7個病例；且上述州幾乎為同時暴發(fā)。其他州的多數(shù)病例都與到這些州旅行相關的暴露有關。

1.2.2 HUS主要發(fā)生于成年人且女性占多數(shù)

在3 222個病例中，810例（25.1%）發(fā)展為HUS，包括27個死亡病例（3.3%，27/810）。約1/4確診病例轉為HUS，這一比例遠高于由EHEC引起的其他暴發(fā)案例。810例HUS患者中，成年人（17歲以上）占89%，平均年齡為43歲；5歲以下者僅占1%，而2001年至2010年德國HUS所有報告病例的平均年齡正好是5歲。又如1996年日本暴發(fā)O157:H7感染時，121例HUS病例均為兒童[8]。

在STEC HUS、STEC胃腸炎病例中，女性分別占68.0%和58.8%，在這兩類病例的死亡者中，女性分別占77.8%和58.3%。

當然，從2011年6月份開始，HUS患者中男性比例有所上升，占47.8%，而5月份這一比例為31.9%。同時與上述德國北部地區(qū)關聯(lián)的病例比例也從早期的86%下降至6月份的63%[9]。

1.2.3 潛伏期與HUS癥狀出現(xiàn)時間

本次STEC O104:H4暴發(fā)病例的潛伏期為8天，與EHEC O157:H7感染的潛伏期（3~4天）相比，STEC O104:H4的潛伏期似乎顯著延長了[9]。對HUS病例，從腹瀉發(fā)展到HUS一般為5天，這一時間與EHEC O157:H7引起的HUS病例從腹瀉到HUS所需7天相比，有所縮短[9]。

1.3 臨床表現(xiàn)

根據(jù)首診于德國漢堡大學醫(yī)學中心（Hamburg University Medical Center，HUMC）的 141個病例的資料[5]，病人中124例為成年人（88%）；成年人中，女性占66%。在兒童病例中，女孩占50%。

臨床特點：（1）不發(fā)熱（37.5℃以上定義為發(fā)熱）；（2）血性腹瀉：59%（10/17）兒童出現(xiàn)，顯著低于成人出現(xiàn)率 96%（114/119）；（3）腹痛：較普遍，兒童病例出現(xiàn)率 92%（12/13），成人出現(xiàn)率 89%（105/118）；（4）嘔吐：兒童常見（69%，9/13），成人少見（20%，20/98）；（5）白細胞：多數(shù)病例白細胞數(shù)正常（約13000個/mm3）；（6）C-反應蛋白：多數(shù)病例升高不明顯（典型病例為15-35mg/L，而正常值為＜5mg/L）。

對于HUS病例（15.6%，22/141），與非HUS病例相比，血紅蛋白明顯下降（P≦0.001）；血小板明顯減少（P＜0.001）；乳酸脫氫酶明顯升高（P≦0.001）；肌酸酐在成人HUS病例明顯升高（P＜0.001）；而在兒童病例接近明顯升高（P=0.08）；此外，成人HUS病例的膽紅素也明顯升高（P＜0.001）[5]。

2 病原學

如上所述，德國STEC O104:H4的暴發(fā)，從臨床上看，主要以血性腹瀉和HUS為特征，更接近于EHEC（如O157:H7）所致的臨床表現(xiàn)?；谶@一原因，有人傾向于將流行株STEC O104:H4歸為EHEC[10]。但由于流行株是EAggEC和EHEC的重組體，且基因組成更接近于EAggEC，有人則傾向于將其歸為EAggEC[11]。當然，從流行株是重組體這一事實出發(fā)，也有人建議為其設立一個新的致病型，即腸聚集性溶血性大腸桿菌（entero-aggregative-haemorrhagic Escherichia coli，EAHEC）[12]。

2.1 STEC O104:H4基因組

STEC O104:H4能在短時間內被認定為EAggEC和EHEC的重組體（或稱雜交體，hybrid），得益于新一代測序手段的應用。該手段使用Ion Torrent Personal Genome Machine（PGMTM）sequencer，可以在62小時內完成分離株基因組的測序[10]。

中國北京基因組研究所（Beijing Genomics Institute，China），采用上述手段完成了1株來自德國2011年5月發(fā)病的16歲女孩的STEC O104:H4分離株TY2482基因組的測序。結果表明，其序列與EAggEC55989株基因組核苷酸的同源性高達99.8%[11]。EAggEC 55989株的血清型也是O104:H4，是從中非共和國一名HIV陽性、并伴持續(xù)性腹瀉的成年患者分離到的，該菌株不產(chǎn)生志賀毒素[13]。

對德國 STEC O104:H4 TY2482株和EAggEC55989基因組作進一步比較，TY2482株的差異部分中的特定區(qū)域包括了前噬菌體的殘跡或完整的前噬菌體，如Stx2前噬菌體，與緊密相關的EHEC O157:H7 EDL933株和Sakai株一樣，該前噬菌體也插入在TY2482株基因組的wrbA位點[11]。與EDL933的stx2基因相比，TY2482株也只有一個核苷酸的不同。

基于德國暴發(fā)的STEC血清型為O104:H4，且臨床表現(xiàn)接近EHEC感染。人們很容易聯(lián)想到流行株與EHEC O104:H4的相關性。德國明斯特大學（U-niversity Münster，Germany） 的 Mellmann 等應用上述新一代測序手段，測定了STEC O104:H4流行株LB226692和2001年從德國1名HUS患者分離到的EHEC O104:H4菌株01-09591[14]的基因組序列。盡管其測定的分離株LB226692與北京基因組研究所的不同，但在基因組組成方面兩者的結論是相似的，即LB226692核心基因組閱讀框與EAggEC55989（NCBI acc.no.NC_011478） 接近，且 EHEC 01-09591核心基因組閱讀框也與后者相似，但LB226692和01-09591株在基因組wrbA位點有Stx2前噬菌體的插入[10]。

上述3個菌株均擁有IrgA同源粘附素（adhesin）的編碼基因（iha），該粘附素介導細菌吸附上皮細胞，而這一粘附素在eae-陰性的STEC中也有發(fā)現(xiàn)[15]。另外，能引起HUS的LB226692、01-09591株還含有亞碲酸鹽抗性基因（ter），而55989株沒有[10]。

根據(jù)基因組測序結果，Mellmann等對德國本次暴發(fā)流行株LB226692的來源提出了2個模型：（1）共同祖先模型（common ancestor modle），即上述三個O104:H4分離株均來自一假定的O104:H4祖先；（2）線性祖先模型（linear ancestry model），即所有 EHEC O104:H4 均來自“原型株”EAggEC559899。作者似乎更傾向于“共同祖先模型”。從假定的共同祖先出發(fā)，LB226692、01-09591、EAggEC 55989 分別通過3、1和6次插入事件進化而來[10]。

對其他暴發(fā)流行分離株的測序結果，均支持本次流行株是在EAggEC55989基因組中插入了Stx2前噬菌體的基礎上形成的[12，16]。

2.2 STEC O104:H4質粒

與基因組測序結果相似，不同來源的德國暴發(fā)流行的STEC 0104:H4分離株有相似的質粒。在TY2482株，出現(xiàn)2個大質粒pESBL TY2482和pAA TY2482，大小分別為88 kb和76kb。pESBL TY2482是不相容群I（Inc I）的質粒，與pEC_Bactec相似，擁有編碼 CTX-M-15 ESBL（extended-spectrum beta-lactamase，廣譜β-內酰胺酶）的基因，還有來自TEM類的β-內酰胺酶（TEM-1）基因，從而賦予TY2482流行株ESBL和TEM-1表型；pAA TY2482與EAggEC 55989株的一個質粒相似，pAA TY2482攜帶編碼聚集性粘附菌毛（aggregative adherence fimbria，AAF）中一個罕見型（AAF/I）的基因簇，而EAggEC 55989株中的相似質粒則含編碼常見型（AAF/III）的基因。當然，TY2482株還含有1個功能未知的1.5 kb的小質粒[11]。

在LB226692也鑒定出了2個類似的大質粒。90kb的質粒與TY2482株的pESBL TY2482質粒相似，也屬不相容群I1（Inc I1），同樣編碼TEM-1和CTX-M-15β-內酰胺酶基因；83kb的質粒，與TY2482株的pAA TY2482質粒相似，也是編碼AAF/I的，同時該質粒不含EAggEC相似質粒常攜帶的編碼熱穩(wěn)定的腸毒素的基因（astA）[10]。

2.3 STEC O104:H4其他生物學特性

Bielaszewska等從德國9個州17個城市22所醫(yī)院收治的暴發(fā)病例的糞樣中分離到80個大腸桿菌分離株，80個分離株均屬0104:H4。根據(jù)7個看家基因（adk，fumC，gyrB，icd，mdh，purA 和 recA）多位點序列分型（multilocus sequence typing，MLST），80 個分離株均為ST678型[17]。

培養(yǎng)特性方面，所有80個分離株均產(chǎn)生β-D-葡萄糖苷酶，均發(fā)酵山梨醇，并對亞碲酸鹽有抗性，均不產(chǎn)生EHEC的溶血素或α-溶血素[17]。

毒力基因方面，80個分離株擁有STEC典型的毒力基因，包括編碼毒素的基因stx2，編碼粘附素的iha，lpfO26，lpfO113基因，以及一個最初鑒定于耶爾森氏菌中編碼鐵攝取系統(tǒng)的高致病毒力島，但缺少編碼緊密素的eae基因。同時，所有80個分離株又具有EAggEC的典型分子特征，擁有毒力質粒（pAA），編碼AAF菌毛I（AAF/I）結構亞單位的基因aggA，編碼EAggEC總調節(jié)子AggR的基因aggR，編碼分散素（dispersin）的基因aap，編碼志賀菌腸毒素1的基因set1和編碼自動轉運體（autotransporter）絲氨酸蛋白酶（與在小腸定居有關的蛋白）的基因pic，但缺少編碼EAggEC熱穩(wěn)定腸毒素1的基因astA[17]。

體外毒力試驗方面，暴發(fā)流行株兼有EHEC和EAggEC的毒力特征，80個分離株對Vero細胞的毒性效價在64-1024（平均效價256）；對人小腸上皮細胞（HCT-8，ATCC CCL-244）產(chǎn)生聚集性（所謂“疊磚式”）粘附方式[17]。

抗生素抗性方面，所有分離株呈現(xiàn)ESBL表型，即抵抗所有青霉素和頭孢菌素類，對碳青霉烯類（厄他培南、亞胺培南、美羅培南）敏感。這一抗性模式是典型的CTX-M-1群β-內酰胺酶相關的模式，證實了CTX-M-15基因型的正確性。另外，所有分離株對復方磺胺藥物（三甲氧芐二氨嘧啶-磺胺甲噁唑）有抗性，對氟喹諾酮類（環(huán)丙沙星）和氨基糖苷類（慶大霉素、妥布霉素）敏感[17]。

2.4 流行菌株及其特性[6]

本次流行菌株為產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）O104:H4血清型，Stx2a志賀毒素陽性，eae緊密素陰性，腸溶血素陰性。歐盟認為，其他非O104:H4血清型，或具Stx1毒素或stx1基因陽性的菌株，均應排除在外。

EAggEC毒力質粒：（1）aatA-PCR陽性（ABC轉運蛋白基因）；（2）aggR-PCR 陽性（毒力質粒的總調節(jié)子基因）；（3）aap-PCR陽性（分泌蛋白分散素基因）；（4）aggA-PCR 陽性（AAF/I菌毛亞單位基因）；（5）aggC-PCR陽性（AAF/I菌毛操縱子基因）。

MLST 序 列 型 ：ST678（adk6，fumC6，gyrB5，icd136，mdh9，purA7，recA7）；ESBL 產(chǎn)物（CTX-M-15）。

有條件時，應對STEC菌株其他特性作進一步鑒定，如完全血清學定型、eae和aggR基因、stx2亞型和MLST基因分型、Xba I脈沖場電泳和廣譜β-內酰胺酶測定（ESBL）。

3 傳染來源或傳播媒介的調查舉例

對于造成本次德國暴發(fā)的STEC O104:H4的來源調查，是德國乃至歐洲相關機構和人員的首要任務。因為只有查明傳染來源，迅速采取措施，才能遏制疫情的蔓延。面對有可能是傳染來源或傳播媒介的眾多食品，風險分析等流行病學研究方法無疑是不可或缺的手段。

如前所述，本次STEC O104:H4首先暴發(fā)于德國北部地區(qū)，其他地區(qū)以及其他國家的病例多數(shù)與到這一地區(qū)旅行而受暴露有關[9]。但是，2011年6月，法國卻發(fā)生了一起獨立的STEC O104:H4感染案例。2011年6月8日，在參加完Begles區(qū)的一次社交聚會后，6月24日法國報告其中部分人發(fā)生了血性腹瀉，至6月28日，已確認8例發(fā)生血性腹瀉，8例發(fā)生HUS。幾乎同時，2011年6月13日，德國也發(fā)現(xiàn)了有41個暴發(fā)群與當?shù)匾患已坎耍╯prouts）生產(chǎn)企業(yè)A有關。這兩個國家?guī)缀跬瑫r暴發(fā)的案例間有無關聯(lián)？工作人員經(jīng)過大量細致的追源（trace back），終于查清了這兩起暴發(fā)案例是關聯(lián)的。即芽菜生產(chǎn)企業(yè)A和法國社交聚會的組織者均使用了2009年11月24日從埃及出口到德國的批號為48088的葫蘆巴（fenugreek）種子，只不過德國芽菜生產(chǎn)企業(yè)A使用的是該批種子的大包裝（75公斤，2011年2月10日從德國分銷商處購進），而法國上述社交聚會的組織者使用的是該批種子的小包裝（50克，2011年6月8日從法國分銷商處購進）[18]。根據(jù)這一結果，歐洲食品安全當局（European Food Safety Authority）提出建議，在短期內，盡全力防止消費者再暴露于這批種子，同時，追蹤除德、法外，歐盟有無第三個國家進口這批種子？總之，要摸清所有這批種子的來源和去向，并采取應對措施。

此前，德國羅伯特科赫研究所也進行過“基于食譜的餐館隊列研究（recipe-based restaurant cohort study）”，結果發(fā)現(xiàn)，消費過芽菜的人感染STEC O104:H4的風險是未消費者的14.2倍（P＜0.01）。而針對芽菜消費的一項專門病例對照研究（case-control studies on the consumption of sprouts）的結果表明，25%的感染病例（6/24）稱食用過芽菜，而健康對照組中這一比例是 9%（7/80）（P=0.043）[9]。

以上列舉了少數(shù)在本次流行中曾被使用的傳染來源或媒介的調查實例，證明了芽菜或/和種子可能是本次暴發(fā)的傳染來源或媒介；同時，在傳染病暴發(fā)時，這些方法的運用，對于盡快找出傳染來源或傳播媒介，從而采取有效措施阻止疫情蔓延至關重要。微生物學實驗的結果往往不能作為傳染來源或媒介的認定依據(jù)，因為特別是“陰性結果”，往往受到分析、診斷方法本身的特點以及采樣計劃等因素的限制[18]。

4 STEC O104:H4暴發(fā)后留下的問題

盡管德國STEC O104:H4暴發(fā)尚未完全結束，但已留下了足夠的問題需要人們思考、解決，以更好地應對類似突發(fā)事件。筆者不妨提出幾個問題，以期拋磚引玉。

4.1 STEC O104:H4幾乎是在EAggEC基因組骨架的基礎上引入了EHEC的stx2基因以及含CTX-M-15的大質粒，為何其毒力升高如此顯著？考慮到這些引入元素都是“可移動元件”，且這一次的“移動”，是在腸道內感染的2種致病型大腸桿菌間進行的，這種“移動”，有無可能擴大到腸道外感染的大腸桿菌？一旦發(fā)生，后果如何？

4.2 EHEC的動物貯主是反芻動物，特別是牛；EAggEC的宿主則是人，引起這次暴發(fā)的STEC O104:H4又是怎么粘附和定居到類似葫蘆巴種子或芽菜上去的？當然這一問題成立的前提是，這些種子或芽菜確實是本次暴發(fā)流行的傳染來源或傳播媒介。

4.3 這次STEC O104:H4暴發(fā)在歐洲（主要是德國），北美略受波及，但都在發(fā)達國家范疇。其損失之大，已為EHEC有史以來所罕見。如果這種暴發(fā)發(fā)生在欠發(fā)達國家甚至貧窮國家呢？如果可能，后者做好準備了嗎？參考文獻：

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