微生態(tài)制劑預(yù)防雞白痢沙門(mén)氏菌感染的應(yīng)用技術(shù)研究

薛俊龍，王國(guó)艷，張偉業(yè)，張國(guó)權(quán)，田林君，劉一飛

（山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，山西太原 030032）

雞白痢和雞傷寒是由雞白痢沙門(mén)氏菌和傷寒沙門(mén)氏菌引起的嚴(yán)重危害雛雞和青年雞的一種細(xì)菌性傳染病，以經(jīng)卵垂直傳播和消化道感染的水平傳播為主，給養(yǎng)雞業(yè)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)該病的防制進(jìn)行了大量的研究和探索[1-3]，我國(guó)目前對(duì)該病的防制主要是通過(guò)檢疫并淘汰陽(yáng)性雞等措施以?xún)艋N雞場(chǎng)。大多數(shù)商品雞飼養(yǎng)者，還是主要通過(guò)抗菌素防治該病，但抗生素使用不當(dāng)或?yàn)E用，往往達(dá)不到控制該病的目的，還常常導(dǎo)致藥物殘留和耐藥菌株的出現(xiàn)[4-5]，近年來(lái)，該病有擴(kuò)大流行的趨勢(shì)[6]。因此，利用微生態(tài)制劑預(yù)防該病[7]，又一次受到人們的重視。本研究使用微生態(tài)制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)排斥方法，建立了符合生產(chǎn)實(shí)際的預(yù)防模型，旨在探討微生態(tài)制劑臨床應(yīng)用的新方法。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基及試劑 SS培養(yǎng)基，購(gòu)自杭州天河微生物試劑有限公司；亞硒酸鹽胱氨酸增菌培養(yǎng)基（S.C）基礎(chǔ)，購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)責(zé)任有限公司；其他試劑均為市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。

1.2 菌種及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清 雞白痢沙門(mén)氏菌C79—13以及標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清，購(gòu)自中國(guó)獸藥監(jiān)察所。

1.3 微生態(tài)制劑 市售的禽用“益生素”（主要益生菌為嗜酸乳桿菌、糞鏈球菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌等），河北某獸藥廠(chǎng)生產(chǎn)。硫酸丁胺卡鈉霉素可溶性粉，購(gòu)自太原某生物技術(shù)有限公司。

1.4 攻毒菌液 將雞白痢沙門(mén)氏菌，接種于SS瓊脂平板，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，而后轉(zhuǎn)菌于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上，37℃恒溫培養(yǎng)24 h，用生理鹽水洗下菌苔，平板稀釋培養(yǎng)計(jì)數(shù)法計(jì)算活菌數(shù)。6日齡攻毒雛雞口服105/只[8]，21日齡時(shí)攻毒6億/只個(gè)活菌。

1.5 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 經(jīng)平板凝集反應(yīng)檢測(cè)，雞白痢和副傷寒均為陰性健康種雞孵育的1日齡海蘭褐公雛300羽。

2 方法

2.1 分組及處理 試驗(yàn)共分6組，每組50只1日齡海蘭褐雛雞。

試驗(yàn)1組：1~3日齡，根據(jù)使用說(shuō)明（每10 g配水200~400 kg）硫酸丁胺卡鈉霉素可溶性粉飲水，4~8日齡，每只每天灌服活菌制劑0.4 mL（含有效活菌量16×108），6日齡時(shí)每只雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒。

試驗(yàn)2組：1~3日齡，根據(jù)使用說(shuō)明（每10 g配水200~400 kg）硫酸丁胺卡鈉霉素可溶性粉飲水，4~8日齡，每只每天灌服微生態(tài)制劑0.4 mL（含有效活菌量16×108），6日齡時(shí)，每只雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒。15~18日齡，根據(jù)使用說(shuō)明（每10 g配水200~400 kg）硫酸丁胺卡鈉霉素可溶性粉飲水，19~23日齡，每只每天灌服活菌制劑0.4 mL（含有效活菌量32×108），21日齡雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒。

試驗(yàn)3組：1~3日齡，根據(jù)使用說(shuō)明（每10 g配水200~400 kg）硫酸丁胺卡鈉霉素可溶性粉飲水，6日齡時(shí)每只雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒。

試驗(yàn)4組：1~5日齡每只每天灌服活菌制劑0.4 mL（含有效活菌量16×108，6日齡時(shí)每只雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒。

攻毒對(duì)照組：6日齡時(shí)每只雛雞滴服雞白痢沙門(mén)氏菌進(jìn)行攻毒，隔離飼養(yǎng)。

空白對(duì)照組：與試驗(yàn)組飼喂同樣的飼料以及相同的管理措施，隔離飼養(yǎng)。

2.2 以上6組，在4日齡、8日齡、15日齡、21日齡、28日齡（試驗(yàn)2組）以及30日齡時(shí)，各隨機(jī)抽取20只，取其泄殖腔棉拭子于S.C增菌液中培養(yǎng)24 h后，無(wú)菌條件下接種于SS瓊脂培養(yǎng)基，37℃恒溫培養(yǎng)24h。

同時(shí)每日觀(guān)察試驗(yàn)雞的健康狀況，記錄發(fā)病和死亡情況；30日齡各組宰殺雛雞10只，觀(guān)察臟器病變，并從十二指腸、空腸、盲腸內(nèi)容物以及肝臟組織分離雞白痢沙門(mén)氏菌。

2.3 攻毒菌鑒定 對(duì)泄殖腔肛拭子、十二指腸、空腸、盲腸內(nèi)容物分離的可疑菌、死亡以及撲殺的雞臟器分離的可疑菌，采用與雞白痢標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清平板凝集試驗(yàn)，進(jìn)行鑒別是否有攻毒菌。

2.4 增重情況 試驗(yàn)雛雞于1日齡時(shí)稱(chēng)重，計(jì)算其每只的平均體重，30日齡時(shí)隨即稱(chēng)重20只，計(jì)算其平均體重。

3 結(jié)果和分析

3.1 試驗(yàn)組臨床癥狀觀(guān)察

各試驗(yàn)組在攻毒前，從精神狀況到采食飲水等均與空白對(duì)照組相同，但自6日齡攻毒后的第四天開(kāi)始，各組均表現(xiàn)不同程度的采食速度減慢，并隨著時(shí)間的推移，采食量減少，個(gè)別精神萎頓、羽毛松亂、腹瀉甚至死亡，具體如下：試驗(yàn)1組，采食速度減慢現(xiàn)象持續(xù)了2天后，開(kāi)始恢復(fù)且很快到正常，11~20日齡各死亡3次死亡5只；試驗(yàn)2組，第一次攻毒后臨床癥狀與試驗(yàn)1組相同，第二次攻毒后，沒(méi)有出現(xiàn)明顯的采食速度減慢和精神不振等臨床癥狀，10~23日齡共死亡8只；試驗(yàn)3組，攻毒后隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，采食量明顯減少，部分雞精神不振，羽毛松亂，腹瀉，排出白色糊狀糞便，并且附著于肛門(mén)周?chē)吕?，?dú)居一隅，發(fā)出“吱吱”的叫聲，并陸續(xù)出現(xiàn)死亡，于11~20日齡共死亡38只；試驗(yàn)4組，臨床表現(xiàn)與試驗(yàn)1組相同，個(gè)別雞精神萎頓，食欲廢絕，最后衰竭而死，從11~23日齡共死亡16只；攻毒對(duì)照組，攻毒后隨著試驗(yàn)的進(jìn)行，臨床癥狀和試驗(yàn)3組相似，于11~22日齡共死亡47只；空白對(duì)照6組，死亡5只。以上臨床癥狀與死亡情況說(shuō)明，由微生態(tài)制劑等組成預(yù)防模型，死亡少，臨床癥狀較輕。

3.2 臨床死亡情況及細(xì)菌分離鑒定

各攻毒試驗(yàn)組臨床死亡病例，解剖的主要病理變化表現(xiàn)為：肝臟腫大，質(zhì)脆，點(diǎn)狀出血，實(shí)質(zhì)中有黃白色壞死灶。3次重復(fù)試驗(yàn)死亡均主要集中于攻毒后的10天內(nèi)（即11~20日齡）具體見(jiàn)表1。

表 1 各組臨床死亡情況及細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

從上表可知，肛拭增菌物在選擇培養(yǎng)基SS平板上的可疑菌落，通過(guò)與雞白痢陽(yáng)性血清的凝集試驗(yàn)，結(jié)果皆為陽(yáng)性反應(yīng)，從而說(shuō)明各試驗(yàn)組的白痢攻毒保護(hù)率為：試驗(yàn)1組為96.7%，試驗(yàn)2組為96%，試驗(yàn)3組為80%，試驗(yàn)4組為94%，攻毒對(duì)照組為76%。結(jié)果表明：雛雞早期飼喂微生態(tài)制劑對(duì)雞白痢病可起到有效地預(yù)防作用。

3.3 試驗(yàn)雞肛拭排菌檢測(cè)結(jié)果通過(guò)對(duì)各模型試驗(yàn)組，三次重復(fù)的60只試驗(yàn)雞攻毒前與攻毒后不同時(shí)間，雞白痢沙門(mén)氏菌肛拭排菌檢測(cè)，結(jié)果SC增菌液皆表現(xiàn)渾濁，SS培養(yǎng)基37℃ 24h培養(yǎng)結(jié)果見(jiàn)表2。

表 2 各組SS培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

從表2結(jié)果可知，試驗(yàn)雞在攻毒前和攻毒后，雞沙門(mén)氏菌病選擇培養(yǎng)基SS平板菌落的顏色為“乳白”和“紅色”兩種，一些“乳白”色菌落中心呈黑色即有H2S產(chǎn)生，但這些可疑菌落與雞白痢陽(yáng)性血清玻板凝集反應(yīng)結(jié)果均為陰性；試驗(yàn)2組，第二次攻毒后一周（28日齡），SS平板菌落均為“紅色”；空白對(duì)照組排菌情況與其它試驗(yàn)組基本相同，無(wú)規(guī)律可循。

3.4 活體撲殺剖檢臟器病變與細(xì)菌分離鑒定

每個(gè)試驗(yàn)組和各對(duì)照組每次重復(fù)試驗(yàn)的每組隨即抽取10只，進(jìn)行活體撲殺剖檢，臟器病變主要表現(xiàn)為：脾臟腫大，肝臟腫大，質(zhì)脆、漿膜上可見(jiàn)出血斑點(diǎn)，實(shí)質(zhì)中有黃白色壞死灶（具體總數(shù)為試驗(yàn)3組7只，攻毒對(duì)照組7只，試驗(yàn)1、2、4組和空白對(duì)照組無(wú)）。肝臟以及消化道各部位沙門(mén)氏菌分離結(jié)果見(jiàn)表3。

由表3可知，無(wú)論被撲殺的雞肝臟有無(wú)病變，皆分離不到雞白痢沙門(mén)氏菌；十二指腸和空腸內(nèi)容物中分離到可疑菌落，陽(yáng)性血清凝集為陰性反應(yīng)，說(shuō)明分離菌不是攻毒的雞白痢沙門(mén)氏菌。

3.5 試驗(yàn)雞增重情況

試驗(yàn)結(jié)束的30日齡，各組雛雞平均體重見(jiàn)下表4。

4 討論

4.1 研究結(jié)果表明，雛雞“1~5日齡口服微生態(tài)制劑”或“1~3日齡使用抗生素，4~8日齡口服微生態(tài)制劑”以及“抗生素使用后，立即使用微生態(tài)制劑”的預(yù)防模型，可有效地保護(hù)雛雞免遭雞白痢沙門(mén)氏桿菌強(qiáng)毒的攻擊，減輕其臨床癥狀，減少雛雞的死亡，提高育雛成活率。

實(shí)際生產(chǎn)中，為了預(yù)防雛雞細(xì)菌性疾病，主要是雛雞白痢沙門(mén)氏菌病和大腸桿菌病，多數(shù)種雞場(chǎng)，建議養(yǎng)殖者1~3日齡在飼料或飲水中投服抗生素（如慶大霉素、阿米卡星等），育雛過(guò)程中尤其在15日齡左右，臨床上雞群有呼吸道疾病發(fā)生時(shí)，基層獸醫(yī)首先提倡或要求使用抗生素進(jìn)行控制，抗生素的頻繁使用嚴(yán)重破壞了雛雞本就不完整的消化道正常菌群，這時(shí)進(jìn)入腸道的細(xì)菌很容易定居，白痢沙門(mén)氏菌也不例外。本研究預(yù)防模型的建立緊密結(jié)合生產(chǎn)實(shí)際，所以其不失為臨床控制雞白痢病較好的生物防治方法。

4.2 研究試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，雛雞白痢桿菌攻毒死亡的雛雞，其肝臟上全部有明顯的壞死病灶，經(jīng)分離培養(yǎng)，選擇培養(yǎng)基SS平板上皆有沙門(mén)氏桿菌可疑菌落生長(zhǎng)，并且與雞白痢沙門(mén)氏菌陽(yáng)性血清發(fā)生凝集反應(yīng)，而30日齡活體撲殺的雛雞，盡管肝臟上也有同樣的壞死病灶（如攻毒對(duì)照組共7只），但選擇培養(yǎng)基SS平板上并無(wú)可疑菌生長(zhǎng)。究其原因，可能是因?yàn)殡u白痢沙門(mén)氏菌在體內(nèi)繁殖致病過(guò)程中，受到雞體自身免疫保護(hù)的強(qiáng)烈抵抗，當(dāng)致病菌的數(shù)量降到臨床致病量臨界值以下時(shí)，即使臟器有病變，但不至于立即死亡而存活。

表3 各組肝臟以及消化道各部位沙門(mén)氏菌分離結(jié)果

表 4 試驗(yàn)雞增重情況

4.3 從表2肛拭排菌試驗(yàn)的結(jié)果中可知，無(wú)論是雞白痢沙門(mén)氏菌攻毒的試驗(yàn)組，還是空白對(duì)照組，選擇培養(yǎng)基SS平板上均有疑似雞白痢沙門(mén)氏桿菌的生長(zhǎng)，但通過(guò)其與陽(yáng)性血清的平板凝集試驗(yàn)皆表現(xiàn)陰性反應(yīng)，即非雞白痢沙門(mén)氏菌，究竟是哪個(gè)屬或那個(gè)種的細(xì)菌等有待進(jìn)一步研究。

4.4 從試驗(yàn)雞增重結(jié)果可知，試驗(yàn)1、2、4組與空白對(duì)照組在30日齡時(shí)，平均增重差異不顯著，但試驗(yàn)組還是比對(duì)照組稍輕，這與攻毒雞早期采食速度減慢甚至減少有關(guān)。但實(shí)際生產(chǎn)中媒介材料雞白痢沙門(mén)氏菌儲(chǔ)量很低或沒(méi)有，加之使用以上預(yù)防模型，臨床上將進(jìn)一步保障雛雞的健康生長(zhǎng)。

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